1. 引言
胡桃醌(Juglone, Jug)化学名称为5-羟基-1,4-萘醌，主要提取自胡桃科胡桃属植物核桃的果实、外果皮以及枝皮中，具有一定的细胞毒性，其中外果皮中的含量最高[1]。可用作染料、颜料、香料、药用等；且易溶于有机溶剂，如乙醇、乙醚等；同时微溶于热水；在常压下，熔点在155℃左右，沸点在250℃左右[2]。胡桃醌表现出广泛的药理作用，其中抗肿瘤活性尤为突出，具有潜在的药用价值[3]。然而，胡桃醌作为胡桃楸提取物中最具应用潜力的抗肿瘤药物单体，因其自身的性质不稳定。例如：温度，pH和光照等都会加速胡桃醌的降解，并且其自身水溶性较差，自身毒副作用较强等原因都限制了其在临床方面的转化[4]。因此，如何将胡桃醌定向输送到病变部位，选择性地杀死病变肿瘤细胞而不对正常细胞产生毒性作用一直是相关科研工作者追求的目标。药物载体技术是一种将药物靶向定位于病灶部位实现靶向和缓释功效的给药方式，且能同时改善药物的水溶性和稳定性，被广泛用于临床试验与治疗中[5]。其中，壳聚糖纳米微球作为一种降解性能优良的功能高分子材料，以其良好的生物相容性，优良的成囊和成膜性能等被广泛用于药物递送[6]。壳聚糖(Chitosan, Cts)作为一种天然阳离子多糖，表面富有大量的反应活性位点，负载药物可以通过化学交联、静电吸附等多种作用方式，在药物表面形成一层“半透膜”，使得药物释放过程需要克服大分子骨架的阻碍，达到缓释控释的目的[7] [8]。同时，壳聚糖纳米颗粒由于氨基的质子化而带正电荷，有利于通过与细胞质膜的相互作用而启动胞吞或者胞饮作用进入细胞，从而提高药物的生物利用率[9]。本项目选用可降解材料壳聚糖(Chitosan, Cts)为负载材料，以三聚磷酸钠(Sodium Tripolyphosphate, TPP)为聚阴离子交联剂，胡桃醌为载带药物，结合离子凝胶法构建一种基于壳聚糖的胡桃醌纳米载药体系。通过单因素试验法考察制备药物载体的影响因素，以响应面试验法优化制备工艺路线；在此基础上，研究分析基于壳聚糖的胡桃醌纳米载药体系的综合性能。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
胡桃醌(Juglone, Jug)购自山东西亚化学有限公司，壳聚糖(Chitosan, Cts)购自上海麦克林生化科技股份有限公司，三聚磷酸钠(Sodium Tripolyphosphate, TPP)购自郑州派尼化学试剂厂，其余试剂均为常规分析纯。
2.2. 实验方法
2.2.1. Jug-Cts-NPs载药体系的制备
Jug-Cts-NPs载药体系的制备采用离子凝胶法。精密称取一定质量的Cts粉末溶于20 mL不同浓度的醋酸溶液中，50℃恒温加热搅拌至完全溶解。然后，使用20 mg/mL的NaOH溶液调节pH值至中性。配制1 mg/mL的Jug乙醇溶液，匀速搅拌条件下以不同比例将Jug乙醇溶液与Cts醋酸溶液混合，之后加入一定量的TPP，常温下搅拌超声10 min，使离子充分交联产生絮状沉淀获得Jug-Cts-NPs混合液。用离心机以8000 r·min−1的转速离心5 min，得Jug-Cts-NPs凝胶，分离上清液，洗涤3次，冻干收集，得褐色海绵状脆性固体，研磨得褐色粉末，并于4℃下低温储存。
2.2.2. 单因素试验确定因素水平
根据文献报道和相关研究，本文以胡桃醌纳米载体中的载药量(DL)和包封率(EE)为指标，单因素选择TPP:Cts、pH值、醋酸浓度和Cts:Jug进行探索测试，设计单因素实验，具体设计如表1所示。
Table 1. Single factor experimental design
表1. 单因素试验设计
序号 |
因素 |
水平 |
1 |
2 |
3 |
4 |
A |
TPP:Cts |
1:3 |
1:4 |
1:5 |
1:6 |
B |
pH值 |
3 |
5 |
7 |
9 |
C |
醋酸浓度/% |
1 |
2 |
3 |
4 |
D |
Jug:Cts |
1:6 |
1:5 |
1:4 |
1:3 |
2.2.3. 响应面试验优化制备工艺
在单因素试验的基础上，以影响较重要的三个主要因素Cts:TPP、pH值、Jug:Cts为试验的因变量，以Jug-Cts-NPs的载药量和包封率为响应值，设计响应面实验，具体设计如表2所示。
Table 2. Responsible surface experimental design
表2. 响应面实验设计
序号 |
因素 |
水平 |
−1 |
0 |
1 |
A |
TPP:Cts |
1:4 |
1:5 |
1:6 |
B |
pH值 |
6 |
7 |
8 |
C |
Jug:Cts |
1:6 |
1:5 |
1:4 |
2.2.4. 胡桃醌壳聚糖纳米载药微球的性能评价
(1) Jug-Cts-NPs载药量和包封率的测定方法
将制备的样品溶液用离心机以8000 r·min−1的转速低温离心5 min，得到上清液。并取适量上清液稀释测量吸光度，利用标准曲线计算上清液中的Jug所占质量，进而计算出载体中包载的Jug质量。同时将下层沉淀冻干后收集称重，为包载胡桃醌壳聚糖微球的质量。Jug浓度与吸光度的线性关系参照标准曲线。检测波长为420 nm，计算Jug-Cts-NPs的载药量(DL)和包封率(EE)：
(1)
(2)
其中，m药为壳聚糖微球中包载的胡桃醌的质量；m总为包载胡桃醌的壳聚糖微球的总质量；m投药为反应中投入的胡桃醌总量。
(2) Jug-Cts-NPs的形态学考察
扫描电镜(SEM)是一种用于观察物体表面结构的电子光学仪器。取一定体积的Jug-Cts-NPs纳米载体粉末用扫描电镜测定微球的外部形态，表面是否平整光滑，粒径是否均匀，分散性是否良好，能得到真实的样品表面形貌，对实验制得的样品做出较精确的分析。
(3) Jug-Cts-NPs体外释放度的测定
取一定量的Jug-Cts-NPs纳米载体粉末，溶解后于10 mL容量瓶中以去离子水定容至刻度线，作为对照；同时取相同量的Jug-Cts-NPs纳米载体粉末，于10 mL容量瓶中，以含60%乙醇生理盐水溶液为释放介质并定容至刻度线，37℃下恒温搅拌(300 r·min−1)；分别于1、2、4、6、8、12、24、48取样，采用紫外测定释放介质中Jug的浓度，并计算药物累积释放百分率。
3. 结果与分析
3.1. 单因素试验结果
3.1.1. TPP:Cts对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
Figure 1. Effect of different proportions of TPP:Cts on drug loading and encapsulation rate of juglone nanospheres
图1. 不同比例TPP:Cts对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
由图1可看出，保持Jug:Cts = 1:5，醋酸浓度为2%，NaOH溶液调节pH = 5，用不同比例的Cts:TPP进行制备，载药量整体数值不大，包封率较大。当TPP:Cts = 1:5时，载药量和包封率均相对较高。可能由于Cts分子带的正电荷氨基基团和TPP带的负电荷磷酸基团之间充分交联反应形成纳米颗粒，当TPP加入量过少时，不能充分交联形成纳米载体。因此，选择Cts:TPP = 1:5作为胡桃醌纳米载药体系构建后续实验药品的用量比例。
3.1.2. pH值对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
由图2可以看出，保持TPP:Cts = 1:2，醋酸浓度为2%，Jug:Cts = 1:5的条件下，制备Jug-Cts-NPs纳米载体，使用NaOH溶液调节反应环境pH为不同的数值。其中，当pH = 7时，载药量和包封率相对较高，载药量可达9.5%，包封率可达79.3%。制得的载体溶液为分散均匀的乳白色悬液，而当溶液pH逐渐增大时，反应溶液中有絮状沉淀析出，可能是由于溶液pH值接近Cts溶液的等电点，使其溶解度降低，粒子间的聚集作用增强，粒径明显增大甚至以沉淀析出。因此，基于以上实验数据，选择pH = 7作为胡桃醌纳米载药体系构建后续实验的药品用量。
Figure 2. Effects of different pH values on drug loading and encapsulation rate of juglone nanospheres
图2. 不同pH值对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
3.1.3. 醋酸浓度对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
Figure 3. Effects of different acetic acid concentrations on drug loading and encapsulation rate of juglone nanocarriers
图3. 不同醋酸浓度对胡桃醌纳米载体载药量和包封率的影响
由图3可以看出，保持TPP:Cts = 1:2，NaOH溶液调节pH = 7，Jug:Cts = 1:5的条件下，制备Jug-Cts-NPs纳米载体，以不同的醋酸浓度溶解Cts粉末。其中载药量和包封率数据整体没有出现明显的波动，当醋酸浓度为2%时，包封率较高可达76.1%。其原因可能是由于醋酸溶液作为溶解Cts粉末的介质，只起到分散溶质的作用，并且会被NaOH溶液中和，因此对实验结果无明显影响。基于以上实验数据，选择醋酸浓度为2%，作为胡桃醌纳米载药体系构建。
3.1.4. Jug:Cts对胡桃醌纳米载体载药量和包封率的影响
从图4可以看出，保持TPP:Cts = 1:2，醋酸浓度为2%，NaOH溶液调节pH = 7的条件下，制备Jug-Cts-NPs纳米载体，以不同比例的Jug:Cts进行制备，载药量和包封率均较之前的数据明显提高，其中当Jug:Cts = 1:5时，载药量较高可达11.5%；包封率较高可达72.1%。可能由于随着投药量的上升，包载Jug的Cts量逐渐减少，导致Jug-Cts-NPs纳米载体的整体包载性能下降，载体囊壁的整体厚度逐渐下降，可能会引起载体内部的Jug的释放，因此载药量有所下降。因此，基于以上实验数据，选择Jug:Cts = 1:5，作为胡桃醌纳米载药体系构建的最佳配比。
Figure 4. Effect of different proportions of Jug:Cts on drug loading and encapsulation rate of juglone nanospheres
图4. 不同比例Jug:Cts对胡桃醌纳米微球载药量和包封率的影响
3.2. 响应面试验结论
响应面实验设计如下：利用Design Expert 8.0.6软件对表3所示数据进行线性拟合分析。其中X1为TPP:Cts；X2为pH值；X3为Jug:Cts。响应面试验为三因素三水平，共分为17组，其中5组为重复性实验，如表3所示。存在两个响应值，分别为载药量和包封率。以此为基础，分析得出相应的响应面图和等高线图，并得出Jug-Cts-NPs纳米载体的最佳制备工艺。
由表4可知，模型的p < 0.0037，表示模型的效果显著；失拟项的p > 0.05，表明回归方程基本无失拟情况，较好；模型的决定系数R2 = 0.9239，说明本实验模型的建立与实际情况重复性较好。此外，对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量的影响程度大小依次为：pH值 > TPP:Cts > Jug:Cts。其中pH值对Jug-Cts-NPs纳米载体的载药量影响是最大的，因此可用来对基于壳聚糖的胡桃醌纳米载药的构建与性能评价的包封率进行初步的分析和预测。
Table 3. Experimental design and results of response surface
表3. 响应面试验设计及结果
序号 |
X1 |
X2 |
X3 |
载药量(%) |
包封率(%) |
1 |
1:5 |
7 |
1:5 |
12.8 |
87.9 |
2 |
1:5 |
8 |
1:4 |
3.9 |
21.1 |
3 |
1:5 |
8 |
1:6 |
4.2 |
49.3 |
4 |
1:6 |
7 |
1:4 |
5.9 |
61.2 |
5 |
1:6 |
6 |
1:5 |
4.9 |
52.6 |
6 |
1:4 |
7 |
1:4 |
3.7 |
15.4 |
7 |
1:5 |
6 |
1:6 |
9.4 |
66.5 |
8 |
1:4 |
7 |
1:6 |
4.0 |
31.6 |
9 |
1:5 |
6 |
1:4 |
6.1 |
49.6 |
10 |
1:4 |
8 |
1:5 |
3.6 |
23.9 |
11 |
1:4 |
6 |
1:5 |
6.2 |
43.7 |
12 |
1:6 |
8 |
1:5 |
7.5 |
53.2 |
13 |
1:6 |
7 |
1:6 |
5.8 |
59.3 |
14 |
1:5 |
7 |
1:5 |
12.4 |
83.1 |
15 |
1:5 |
7 |
1:5 |
11.9 |
78.3 |
16 |
1:5 |
7 |
1:5 |
12.7 |
86.4 |
17 |
1:5 |
7 |
1:5 |
10.0 |
75.0 |
Table 4. Anova table with drug loading of Jug-Cts-NPs nanocarrier as response value
表4. 以Jug-Cts-NPs纳米载体的载药量为响应值的方差分析表
方差来源 |
平方和 |
df |
均方 |
F值 |
P值 |
显著性 |
模型 |
180.42 |
9 |
20.05 |
9.44 |
0.0037 |
显著 |
A：TPP:Cts |
5.44 |
1 |
5.44 |
2.56 |
0.1534 |
|
B：pH值 |
6.84 |
1 |
6.84 |
3.22 |
0.1157 |
|
C：Jug:Cts |
1.80 |
1 |
1.80 |
0.85 |
0.3873 |
|
AB |
6.76 |
1 |
6.76 |
3.18 |
0.1176 |
|
AC |
0.040 |
1 |
0.040 |
0.019 |
0.8947 |
|
BC |
2.25 |
1 |
2.25 |
1.06 |
0.3376 |
|
A2 |
60.16 |
1 |
60.16 |
28.33 |
0.0011 |
|
B2 |
31.38 |
1 |
31.38 |
14.78 |
0.0063 |
|
C2 |
49.54 |
1 |
49.54 |
23.32 |
0.0019 |
|
残差 |
14.87 |
7 |
2.12 |
|
|
|
失拟度 |
8.54 |
3 |
2.85 |
1.80 |
0.2871 |
不显著 |
纯误度 |
6.33 |
4 |
1.58 |
|
|
|
总离度 |
194.28 |
16 |
|
|
|
|
由表5可知，模型的p < 0.0015，表示模型的效果显著；失拟项的p = 0.1277 > 0.05，表明回归方程基本无失拟情况，较好；模型的决定系数R2 = 0.9414，说明本实验模型的建立与实际情况重复性较好。此外，对Jug-Cts-NPs纳米载体包封率的影响程度依次为：TPP:Cts > pH值 > Jug:Cts。由此可以看出，TPP:Cts对Jug-Cts-NPs纳米载体的包封率影响是最大的，因此可用来对基于壳聚糖的胡桃醌纳米载药的构建与性能评价的包封率进行初步的分析和预测。
Table 5. Anova table with encapsulation efficiency of Jug-Cts-NPs nanocarrier as response value
表5. 以Jug-Cts-NPs纳米载体的包封率为响应值的方差分析表
方差来源 |
平方和 |
df |
均方 |
F值 |
P值 |
显著性 |
模型 |
8021.06 |
9 |
891.23 |
12.50 |
0.0015 |
显著 |
A：TPP:Cts |
1559.61 |
1 |
1559.61 |
21.87 |
0.0023 |
|
B：pH值 |
526.50 |
1 |
526.50 |
7.38 |
0.0299 |
|
C：Jug:Cts |
441.05 |
1 |
441.05 |
6.18 |
0.0418 |
|
AB |
104.04 |
1 |
104.04 |
1.46 |
0.2663 |
|
AC |
81.90 |
1 |
81.90 |
1.15 |
0.3194 |
|
BC |
31.92 |
1 |
31.92 |
0.45 |
0.5249 |
|
A2 |
2023.10 |
1 |
2023.10 |
28.37 |
0.0011 |
|
B2 |
1241.30 |
1 |
1241.30 |
17.41 |
0.0042 |
|
C2 |
1463.73 |
1 |
1463.73 |
20.53 |
0.0027 |
|
残差 |
499.17 |
7 |
71.31 |
|
|
|
失拟度 |
362.12 |
3 |
120.71 |
3.52 |
0.1277 |
不显著 |
纯误度 |
137.05 |
4 |
34.26 |
|
|
|
总离度 |
8520.24 |
16 |
|
|
|
|
由Design-Expert8.0.6软件可以得出不同实验因素和实验水平对Jug-Cts-NPs纳米载体的载药量和包封率的影响，图5~10为各因素所对应的3D图和等高线图。由图可以反映出Jug-Cts-NPs纳米载体样品中，各因素对应的载药量和包封率随实验因素的改变所呈现的变化趋势，分析所得的结果较为准确。可更准确地确定最佳制备工艺方法。其分析结果如下。
Figure 5. Contour plot and response surface plot of the interaction of TPP:Cts (A) and pH (B) on the drug loading of Jug-CTS-NPS nanocallers
图5. TPP:Cts (A)和pH值(B)对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量的交互作用的等高线图和响应面图
图5、图6为TPP:Cts (A)和pH值(B)对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的响应曲面和等高线图。由图中可以看出，Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率整体呈现先递增再递减的趋势，整体曲线平面呈现先递增再递减的趋势，在中间某一点载药量达到最高，以中心的某一点最高。pH值对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的影响较大，斜面坡度较TPP:Cts的斜面坡度更陡。其次，等高线图均呈现椭圆形，表明pH值和TPP:Cts两个因素之间相互作用效果显著，对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的影响较大。
Figure 6. Contour plot and response surface plot of the interaction of TPP:Cts (A) and pH (B) on the encapsulation efficiency of Jug-CTS-NPS nanocallers
图6. TPP:Cts (A)和pH值(B)对Jug-Cts-NPs纳米载体包封率的交互作用的等高线图和响应面图
Figure 7. Contour plot and response surface plot of the interaction of TPP:Cts (A)and Jug:Cts (C) on the drug loading of Jug-CTS-NPS nanocallers
图7. TPP:Cts (A)和Jug:Cts (C)对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量的交互作用的等高线图和响应面图
图7、图8为TPP:Cts (A)和Jug:Cts (C)对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的响应曲面和等高线图。由图中可以看出，Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率整体呈现先递增再递减的趋势，整体曲线平面呈现先递增再递减的趋势，在中间某一点载药量达到最高，以中心的某一点最高。其中，Jug:Cts对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的影响较大，斜面坡度较TPP:Cts的斜面坡度更陡。其次，等高线图均呈现椭圆形，表明Jug:Cts和TPP:Cts两个因素之间相互作用效果显著，对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量和包封率的影响较大。
Figure 8. Contour plot and response surface plot of the interaction of TPP:Cts (A) and Jug:Cts (C) on the encapsulation efficiency of Jug-CTS-NPS nanocallers
图8. TPP:Cts (A)和Jug:Cts (C)对Jug-Cts-NPs纳米载体包封率的交互作用的等高线图和响应面图
Figure 9. Contour plot and response surface plot of the interaction of pH (B) and Jug:Cts (C) on the drug loading of Jug-CTS-NPS nanocallers
图9. pH值(B)和Jug:Cts (C)对Jug-Cts-NPs纳米载体载药量的交互作用的等高线图和响应面图
Figure 10. Contour plot and response surface plot of the interaction of pH (B) and Jug:Cts (C) on the encapsulation efficiency of Jug-CTS-NPS nanocallers
图10. pH值(B)和Jug:Cts (C)对Jug-Cts-NPs纳米载体包封率的交互作用的等高线图和响应面图
3.3. 验证试验
3.3.1. Jug-Cts-NPs载药量和包封率的测定结果
从响应面实验中可以看出，TPP:Cts，pH值和Jug:Cts对Jug-Cts-NPs纳米载体的载药量和包封率的影响都较为显著，其中两两因素所分析出的响应面图和等高线图都较显著地表明了相互因素之间的影响规律。在最终的软件分析之后，得到了Jug-Cts-NPs纳米载体的最佳制备工艺为TPP:Cts = 1:5.3，pH = 6.83，Jug:Cts = 1:5.12。为使验证实验操作简便，因此将最佳制备工艺调整为TPP:Cts = 1:5，pH = 7，Jug:Cts = 1:5。由表6可知，三组平行实验的整体载药量和包封率较高，其中平均载药量为11.67%，平均包封率为83.5%，与预测值相吻合，采用响应面试验优选出的最佳工艺精确性高、稳定性好，可作为Jug-Cts-NPs纳米载药体系制备工艺。
Table 6. Drug loading and encapsulation efficiency of Jug-Cts-NPs nanocarriers
表6. Jug-Cts-NPs纳米载体的载药量和包封率
序号 检测指标 |
1 |
2 |
3 |
载药量(%) |
11.3% |
10.9% |
12.8% |
包封率(%) |
84.1% |
78.6% |
87.9% |
3.3.2. Jug-Cts-NPs表征测定结果
SEM结果如图11所示，Jug-Cts-NPs纳米载体结构表现为海绵状，存在较密集的孔道结构，整体结构较为疏松，可将Jug吸附于载体孔道之中，实现Jug的载带。此种结构可以实现更多剂量药物的载带，将Jug输送到人体病变部位，较为集中地作用于该病变部位，可减少药物对人体其他部位造成的损伤。
Figure 11. SEM images of Jug-Cts-NPs nanocarriers
图11. Jug-Cts-NPs纳米载体的SEM照片
3.3.3. Jug-Cts-NPs体外释放度测定结果
以平行制备的三组样品为释放材料，以60%乙醇生理盐水溶液为释放介质，在不同的时间段使用紫外分光光度计进行含量测定，检测Jug-Cts-NPs纳米载体的体外释放情况，如图12所示。在整体情况下，Jug-Cts-NPs纳米载体的体外释放量呈现增加的趋势，约前10 h内释放速率较快，释放曲线斜率较大，是由于吸附在纳米颗粒表面的药物所导致，在48 h内的累积释放量最高达79.1%，具有较好的体外缓释性能。药物在体内的突然释放可迅速达到有效治疗浓度，而持续释放可使药物停留在有效治疗浓度范围。
Figure 12. SEM images of Jug-Cts-NPs nanocarriers
图12. Jug-Cts-NPs纳米载体的SEM照片
4. 结论
综上所述，当TPP:Cts = 1:5、醋酸浓度 = 2%、pH = 7、Jug:Cts = 1:5时，胡桃醌纳米载药体系的载药量和包封率最佳，其中载药量最高可达到12.8%，包封率最高可达到87.9%。以响应面实验优化后的处方制备得到的Jug-Cts-NPs纳米载体溶液呈橙黄色悬浊液，离心后得橙黄色胶体，冻干得褐色海绵状脆性固体，研磨可得褐色粉末。在平行验证实验中可以得出如下结论：三组样品的整体载药量和包封率较高，其中平均载药量为11.67%，平均包封率为83.5%。在SEM下观察，Jug-Cts-NPs纳米载体结构表现为海绵状，存在较密集的孔道结构，整体结构较为疏松，可将Jug吸附于载体孔道之中，实现Jug的载带。以60%乙醇生理盐水溶液为释放介质，验证Jug-Cts-NPs纳米载体的体外释放性能，约前10 h内药物释放速率较快，释放曲线斜率较大，在48 h内的累积释放量最高达79.1%，表明实验制备的Jug-Cts-NPs纳米载体整体释放性能良好，整体性能较好。
基金项目
陕西省科技创新团队项目(2022TD-56)；陕西省教育厅服务地方专项科研计划项目(22JC031)；陕西省大学生创新创业训练计划项目(S202211396051)。
NOTES
*通讯作者。