1. 引言

性早熟是儿科最常见的内分泌疾病之一，近年来发病率呈现上升趋势。据有关统计目前我国儿童性早熟的平均发病率已经达到l%，在某些经济发达的城市更高达3% [1]。性早熟可分为中枢性、外周性和部分性性早熟，其中中枢性性早熟多见。临床上性早熟以女孩高发，女孩与男孩之比约为23:1，女孩中枢性性早熟中约80%~90%为特发性中枢性性早熟[2]-[5]。福建中医药大学附属第二人民医院儿科是福建省最早开展中西医结合治疗性早熟的医疗机构之一，科室自拟经验方育阴散具有滋阴降火之功效，临床广泛应用于阴虚火旺型性早熟的治疗，疗效显著，在乳核指数、中医相关证候积分、抑制性征发育及骨龄增长等方面优于对照组[6]。本研究通过达那唑法建立大鼠中枢性性早熟模型，探讨育阴散对该模型大鼠的子宫和卵巢指数、以及血清中性激素水平的影响，总结分析其疗效，现报道如下。

2. 实验材料

2.1. 动物

40只健康清洁级SD大鼠均为3日龄雌性，与母鼠共同饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食和饮水，在出生后21天断奶。实验动物环境和设备由福建中医药大学动物实验中心提供。

2.2. 药物

育阴散组成：生地9 g、玄参6 g、泽泻6 g、知母9 g、黄柏9 g、龟板9 g、麦芽9 g、炙甘草3 g。中药材由福建中医药大学附属第二人民医院中药房提供并负责煎煮，生药浓度为2.0 g/mL。

3. 实验方法

3.1. 分组及造模

40只SD大鼠按照随机数字表法分为正常组(N组)、模型组(M组)、生理盐水干预组(MS组)、中药干预组(TCM组)，每组10只。M组、MS组、TCM组于5日龄时每只幼鼠皮下注射达那唑300 μg，每300 μg达那唑溶解于25 μl体积比为1:1乙二醇/乙醇混合液中[7]。以阴门开启作为青春期启动的标志。

3.2. 给药和取材

从15日龄开始，TCM组和MS组大鼠每天分别给予中药和生理盐水灌胃干预，每隔5天于上午9点各组大鼠称重一次。采用通用换算公式计算TCM组大鼠给药剂量，经计算给药剂量为1.45 mL/100 g/d，MS组按照相同剂量给予生理盐水灌胃，直至取材为止。M组于阴门开启时作为处死时间点，其余三组同时选取性对应数量的大鼠一并处死。采用直接断头法处死取材，留取外周血，分离血清留存备用；对子宫、卵巢进行称重。实验所用器械及EP管等均经DEPC水浸泡，蒸馏水冲洗，高温高压消毒。

3.3. 阴门开启时间及性器官指数

从15日龄开始，每天观察并记录各组大鼠阴门开启情况。取材时对各组大鼠的子宫和卵巢进行称重，计算器官系数，器官指数 = 器官湿重量/体重。

3.4. 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清LH、FSH、E2水平

取外周血，4℃下4000 r/min离心10 min，分离血清备用。各孔加入血清50 μL，然后加入工作液50 μL，覆盖封板膜，37℃培养箱中孵育30 min。依次洗涤、弃液、甩干，加入洗涤液静置30 s后弃液，重复5次。加入50 μL过氧化氢酶，37℃培养箱中孵育30 min，重复上述洗涤过程。依次加入显色剂A、B，避光显色10 min，加入终止液，450 nm波长测定各孔吸光度(OD值)。

3.5. 统计方法

应用SPSS22.0对数据进行统计分析，结果均以平均值 ± 标准差( $\bar{\text{x}}\pm \text{s}$)表示。首先对数据进行正态检验和方差齐性检验，同时符合正态分布并且方差齐性的数 据，采用One-Way ANOVA单因素方差分析进行组间分析；若不属正态分布或方差不齐则采用Kruskal-Wallis H秩和检验法进行检验。检验结果以P < 0.05表示差异有统计学意义。

4. 结果

4.1. 育阴散对雌性性早熟大鼠青春期启动的影响

M组和MS组大鼠于21日龄时出现阴门开启，至24日龄两组大鼠全部出现阴门开启，N组和TCM组大鼠均未见阴门开启，各组大鼠阴门开启情况见表1。

Table 1. Vulva opening of rats in each group

表1. 各组大鼠阴门开启情况

4.2. 育阴散对雌性性早熟大鼠性器官指数的影响

在23日龄时，M组和MS组大鼠子宫指数和卵巢指数均明显高于N组；TCM组则显著低于M组和MS组，但与N组无明显统计学差异。各组大鼠性器官指数具体结果见表2。

Table 2. Sex organ index of rats in each group (n = 10)

表2. 各组大鼠性器官指数(n = 10)

注：与N组比较，^▲P < 0.05，^*P > 0.05；与M组和MS组比较，^*P < 0.05。

4.3. 育阴散对雌性性早熟大鼠性激素水平的影响

与N组相比，M组和MS组血清LH和E2水平均明显升高，TCM组与M组和MS相比，血清LH和E2水平则显著降低；但TCM组与N组相比，LH水平无显著差异，但E2水平则明显高于N组。各组大鼠性激素水平具体结果见表3。

Table 3. Sex hormone levels of rats in each group (n = 10)

表3. 各组大鼠性激素水平(n = 10)

注：与N组比较，^▲P < 0.05，^*P > 0.05，^#P < 0.05；与M组和MS组比较，^*P < 0.05，^#P < 0.05。

5. 讨论

当今社会，性早熟患儿逐年增多，此类患儿在出现第二性征的同时，骨骼生长加速，骨骺提前闭合，一定程度会影响最终身高。另外，性早熟女孩乳房早发育、初潮早现，还可导致自卑、抑郁、社交退缩等一系列心理行为问题，且发生早恋、早孕的风险增大，最终会对家庭乃至社会产生负面影响[8]。所以儿童性早熟特别是女童性早熟已成为社会、家庭等关注的公共卫生问题。中枢性性早熟的确切病因及触发机制不是十分清楚，但遗传和环境因素共同影响了疾病的发生与发展的观点被广泛接受[9]。目前研究显示[10]，特发性性早熟病因可能是在环境因素、过早接触“儿童不宜”的影视作品、长期摄入含有性激素的食物、过食某些滋补品、营养过剩等诸多危险因素的刺激下，导致下丘脑的神经内分泌调节功能异常，提早产生过多的促性腺激素释放激素，导致性发育提前启动且功能亢进。

育阴散是由知柏地黄丸和大补阴丸化裁而成，相比两方合用，药味更加精简，药量明显减少，一定程度上改善了患儿服药苦难、依从性差的弊端。育阴散以滋阴降火为主，组方生地、玄参、泽泻、知母、黄柏、龟板、麦芽、炙甘草。知柏地黄丸及大补阴丸均为“滋阴降火”之名方，但因小儿稚阴稚阳之体，脏腑娇嫩，不适用补益过于滋腻的熟地黄，故改为生地黄。明代的《本草经疏》中提到生地黄为“补肾家之要药，益阴血之上品”。明代医家戴元礼曰：阴微阳盛，相火炽盛，来乘阴位，日渐煎熬，阴虚火旺之证，宜生地黄滋阴退阳。真阴亏损，虚火上炎，以玄参滋阴抑火，为清补肾经之要药。龟板味咸甘而性情平和，龟板得水之精气而生，治肾水不足，入肾以滋阴。黄柏能制命门阴中之火，知母制肾水化源之火，以保存阴液，知母佐黄柏滋阴降火。泽泻甘淡性寒，入肾经，泻肾中之虚火，使真阴得复其位。麦芽宽中开胃，以除烦闷，能消徵瘕气结、郁结痰涎，入本方理气和胃，回乳散结。炙甘草不仅调和诸药，且能补脾和胃，蜜炙法改善中药口味，为患儿所喜。育阴散较知柏地黄丸合大补阴丸药味精简，药材费用更加经济，有利于临床广泛辨证应用。

本研究应用育阴散干预雌性性早熟模型大鼠，结果显示育阴散可以延缓性早熟大鼠阴门开启时间，抑制性器官发育，并且能够降低血清LH和E2的水平，从而达到预防性早熟的作用。但该中药方剂的作用机制尚不明确，从分子水平上深度研究育阴散的作用机制，有利于该方药更好的服务临床，提高诊疗效果，这也是今后进一步研究的目标和方向。

基金项目

福建省自然科学基金卫生联合面上项目，项目编号2021J01885。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献