1. 引言

草菇(Volvariellavolvacea(Bull.) Singer)是热带、亚热带常见的食用菌，也是我国南方广泛种植的食用菌，草菇属于伞菌目，光柄菌科，草菇属[1]。草菇肉质细腻脆嫩，味道鲜美，含有丰富的蛋白质，常被作为重要的蛋白质食物来源之一[2][3]。此外，草菇中还含有丰富的海藻糖、纤维素和维生素C等物质，其中维生素C可以预防坏血病等[4]，因此草菇深受消费者的青睐。近年来，市场需求逐年增多，草菇生产规模也随之增大，并形成工厂化生产，由此对草菇菌种生产提出了更高的要求[5]-[8]。相对食用菌固体菌种而言，液体菌种可以满足草菇工厂化生产的需要，因此越来越多的企业、专家与学者积极进行草菇液体菌种生产工艺改进和研究，期望生产出高质量的菌种，以适应草菇工厂化生产的需要[9]-[13]。本实验采用单因素试验的方法，对草菇液体菌种进行摇床培养，通过对草菇培养基配方、摇床转速、液体培养基装液量、摇前静置时间、维生素B₁浓度等五个培养条件的试验，探讨适合草菇液体菌种生长的最佳培养条件，为改进草菇液体菌种生产工艺提供借鉴和支持。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 供试菌株

从当地市场上购买新鲜的草菇，经子实体组织分离后获得。

2.1.2. 药品及试剂

蔗糖、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B₁等。

2.1.3. 仪器设备

手提式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-18SI型)、超净工作台(SW-CJ-1F型)、天呈恒温培养振荡器(TS-211C型)、生化培养箱(SPX-150型)、电热鼓风干燥箱(GZX-9030MBE型)、电子天平(HC-C型)等。

2.1.4. 斜面培养基

去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1000 mL，pH自然。

2.2. 试验方法

2.2.1. 一级菌种的制备

1) 培养基的制备：从市场上挑选新鲜无芽马铃薯，洗净去皮称取200 g，用去离子水煮至熟而不烂，把漏斗放在三脚架上用六层纱布过滤取滤液，把滤液重置锅中加入去离子水煮沸，加入称好的琼脂和葡萄糖，pH自然，待葡萄糖和琼脂完全溶解后加水定容至1000 mL，用漏斗分装试管，塞上棉塞，用牛皮纸和麻绳包扎成捆，121℃条件下高压灭菌30 min，摆斜面制得PDA斜面固体培养基。

2) 母种制备：采用菌柄组织块分离法制备母种。先把草菇菌柄用无菌水清洗一遍，放进超净工作台，用75%的酒精消毒，用无菌滤纸吸干草菇表面水分，从菌柄处开始把草菇撕成两半，用灭菌过的解剖刀在菇盖与菌柄交界的地方划成井字，切取0.5 × 0.5 cm的组织块，然后接到PDA培养基上，放置25℃的恒温箱中培养7 d，再通过转管获得一级母种。

2.2.2. 草菇液体菌种培养基配方的筛选

草菇液体菌种生长所需要的营养物质有碳素营养、氮素营养、维生素及矿物质等。其中，比较常见的碳素营养物质有马铃薯、蔗糖、葡萄糖等；常用的氮素营养物质是酵母膏、蛋白胨等；KH₂PO₄、MgSO₄和维生素B₁则是常用的矿物质和维生素；洋葱是一种新型的综合营养物质。

为获得良好的草菇液体菌种培养基配方，利用上述营养物质设计三个配方进行对比试验，培养基配方成分见表1。

Table 1.Composition table of the tested formula (g/L)

表1.供试配方成分表(g/L)

方法：按照配方分别制备以上的三种培养基各1000 mL，pH为自然，然后把每种配方的培养液用漏斗和量筒分别装100 mL到250 mL的锥形瓶，每种培养基各十瓶，贴好标签，用封口膜和牛皮纸封三角锥形瓶瓶口，在121℃高压条件下灭菌30 min，静置24 h观察没有污染之后，和试管母种放至无菌超净工作台，打开紫外灯消毒30 min，把2粒0.5 × 0.5 cm的母种接入液体培养基，在33℃的培养箱中静置培养24 h后，转移至摇床，设定摇床转速120 r/min、温度33℃的条件下培养6 d，每天观察和记录实验各个时间段菌丝球的大小、均匀度、密度、布满培养基等情况，培养结束后测定菌丝体干重，试验设置三个重复，选出最适合的培养基配方。

2.2.3. 草菇液体菌种摇床培养条件的对比试验

通过以上草菇液体菌种培养基配方的比较试验，筛选出草菇液体菌种培养基配方：马铃薯50 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄0.5 g，维生素B₁10 mg，水1000 mL，pH自然。在此基础上设计摇床转速、维生素B₁添加浓度、培养基装瓶量、摇前静置时间等四个因子，进行草菇液体菌种摇床培养的对比试验。

1) 液体菌种的不同摇床转速对比试验

按上述的配方配制培养液，并装入规格为250 mL的锥形瓶中，装瓶量为100 mL，用封口膜和牛皮纸包扎封瓶，高温高压灭菌30 min后备用，共制备90瓶溶液。在无菌条件下，接入0.5 × 0.5 cm的试管母种，每瓶2粒，移至33℃的恒温培养箱静置培养24 h后，转移至摇床上振荡培养6 d，培养温度为33℃，做好观察记录。摇床转速设置为：110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 r/min十个梯度，每一个梯度设置试验量9瓶。

2) 液体培养基添加不同浓度的维生素B₁对比试验

液体培养基配方同上，摇床转速为130 r/min，添加维生素B₁浓度设置为：0、5、10、15、20 mg/L五个梯度。每个梯度配置1000 mL的培养液，分装规格为250 mL的锥形瓶，装瓶量为100 mL，每个梯度配制10瓶，用封口膜和牛皮纸包扎封瓶高温高压灭菌30 min后备用，在超净工作台上进行无菌操作，将两粒0.5 × 0.5 cm的母种接入锥形瓶的培养液中，移至33℃的恒温培养箱静置培养24 h后，再进行摇床培养6 d，培养温度为33℃，做好观察记录。

3) 不同培养液装瓶量的对比试验

按上述配方配制培养液，并装入规格为250 mL的锥形瓶中，装瓶量设置为：50、60、70、80、90、100 mL六个梯度，每个试验梯度为10个250 mL的锥形瓶，绑好封口膜和牛皮纸，在121℃高压条件下灭菌30 min，冷却后，在超净工作台上将两粒0.5 × 0.5 cm的母种接入锥形瓶的培养液中，移至33℃的恒温培养箱静置培养24 h后，摇床振荡培养6 d，做好观察记录。

4) 液体菌种摇前静置时间对比试验

按上述配方配制培养液，并装入规格为250 mL的锥形瓶中，装瓶量为100 mL，用封口膜和牛皮纸包扎封瓶，高温高压灭菌30 min，冷却后，在超净工作台上将两粒0.5 × 0.5 cm的母种接入锥形瓶的培养液中，移至33℃的恒温培养箱静置培养，静置培养时间分别设置为：0、12、24、36、48 h五个梯度，每个梯度设置试验量为9个，摇床转速为130 r/min，摇床培养6 d，做好观察记录。

2.2.4. 相关指标的说明和测量

本试验通过菌丝球的生物量、密度、均匀度和形状等方面来判断菌丝的生长状况是否良好，菌丝球的生物量越大，密度、均匀度越好，说明菌丝的生长状况越好，反之则差。

1) 菌丝球生物量的测量

培养结束后，将培养液用4层纱布过滤，蒸馏水冲洗3次，收集菌丝球，将菌丝球放入培养皿中，置于60℃烘干箱中烘干至恒重(烘干2 h后测量一次，此后每隔30 min测量一次，直至与上次测量的值相差不大于2 mg方为恒重)，用分析天平称量干重。菌丝体生物量(g/100 mL) = 菌丝体干重/培养液体积。

2) 菌丝球均匀度指标

培养结束后，根据菌丝球直径及密度大小，采用肉眼目测的方法确定菌丝的均匀度。用“+”号表示均匀度，“+”代表均匀度较差，“++”代表均匀度良好，“+++”代表均匀度最佳。

3) 菌丝球密度指标

菌丝球的密度用“*”表示，其中“*”代表菌丝球密度较差，“**”代表菌丝球密度良好，“***”代表菌丝球密度最佳。

3. 结果与分析

3.1. 不同配方的培养基对液体菌种生长的影响

不同配方的液体培养基菌丝球的生长状况见表2。

Table 2.Growth status of fungal mycelium balls in liquid culture media with different formulations

表2.不同配方的液体培养基菌丝球的生长状况

从表2可以看出，不同液体培养基配方对菌丝球生长的影响是有差异的，从菌丝球的生物量、密度、均匀度和形状来看，配方二的比较好，菌丝球含量最高，菌丝球干重在重复多次称量中变化差距最小，且均匀度最好。配方一有部分菌丝形成了条状，而配方三表现较差，所以最适的配方应该为配方二，即马铃薯50 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄0.5 g，维生素B₁10 mg，水1000 mL，pH自然。

3.2. 草菇液体菌种摇床培养条件对比试验的结果与分析

3.2.1. 摇床转速对菌丝球生长的影响

不同摇床转速菌丝球的生长状况见表3。

Table 3.Comparison of growth status of fungal mycelium balls at different shaking table speeds

表3.不同摇床转速菌丝球的生长状况比较

从表3可以看出，不同的摇床转速对菌丝球生长是有影响的，从菌丝球的生物量、密度、均匀度和形状来看，摇床转速为130 r/min的菌种生长最好，菌丝球的生物量最大，菌丝球密度最佳，菌丝球均匀度最好，因此，草菇液体菌种培养最适合的摇床转速是130 r/min。

3.2.2. 液体培养基添加不同浓度的维生素B₁对菌丝球生长的影响

液体培养基中添加不同浓度的维生素B₁，菌丝球的生长状况见表4。

Table 4.Growth status of mycelium balls with different concentrations of vitamin B₁added to liquid medium

表4.液体培养基中添加不同浓度的维生素B₁菌丝球的生长状况

根据表4，从菌丝球的生物量来看，维生素B₁在0至15 mg/L时，菌丝球生物量呈上升趋势，其中，当维生素B₁浓度为15 mg/L时，菌丝球生物量最大；当维生素B₁浓度为20 mg/L时，菌丝球生物量有所下降。另外，从菌丝球的密度、均匀度和直径来看，当维生素B₁浓度为15 mg/L时，菌丝球直径小而均匀，且密度大，综上所述，草菇液体菌种培养添加的维生素B₁最佳浓度为15 mg/L。

3.2.3. 不同的培养基装瓶量对菌丝球生长的影响

不同的培养基装瓶量对菌丝球生长的影响见表5。

Table 5.Growth status of fungal mycelium balls with different bottling volumes on different culture media

表5.不同培养基装瓶量菌丝球的生长状况

表5表明，从观察到的菌丝球密度、均匀度和测量的生物量来看，规格为250 mL锥形瓶，培养基的装瓶量为80 mL的培养效果最好，菌丝球生物量最大，菌丝球较密、均匀。装瓶量为50 mL的，菌丝球生长不均匀，主要原因是摇瓶装液量较少，溶液在摇床上振荡的时候没有得到充分摇匀。当装瓶量为100 mL时，装液量的体积对于接入的菌丝粒偏大，营养过多，导致菌丝部分形成较大的菌丝球，均匀度也一般。

3.2.4. 摇前静置时间对菌丝球生长的影响

不同的静置时间对菌丝球生长的影响见表6。

Table 6.Growth status of fungal mycelium balls at different settling times

表6.不同静置时间菌丝球的生长状况

由表6可知，静置时间在0~36 h时，菌丝球的生物量呈增长趋势，静置培养36 h时，菌丝球的生物量最大，菌丝球的密度、均匀度最好，因此培养基静置36 h再进行摇床培养效果最好。静置培养48 h时，菌丝生长不均匀，菌丝的形状出现了柱状，原因是静置时间过长，接入的母种菌丝在温度适合的条件下，生长旺盛，菌丝长得较长，部分交叉盘绕在一起，经过120 r/min的摇床培养后，造成受力不均，无法形成菌球而变成了柱状，综合分析得出静置36 h最佳。

4. 小结

本试验第一阶段的研究内容是，设计三个配方进行草菇液体菌种摇床培养对比试验，设定摇床转速为120 r/min、温度为33℃的条件下培养6 d。通过菌丝球的生物量、密度、均匀度和形状等指标进行对比，判断菌丝的生长状况，从而筛选出最适合的培养基配方。研究结果表明：最适合的培养基配方是马铃薯50 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄0.5 g，维生素B₁10 mg，水1000 mL，pH自然。

试验第二阶段的研究内容是，在第一阶段研究的基础上设计摇床转速、培养基装瓶量、维生素B₁添加浓度、摇前静置时间等四个因子，进行草菇液体菌种摇床培养的对比试验。试验结果表明：草菇液体菌种培养最适合的摇床转速是130 r/min；添加的维生素B₁最佳浓度为15 mg/L；培养基静置36 h再进行摇床培养效果最好；规格为250 mL的锥形瓶，培养液的装瓶量为80 mL的培养效果最好，菌丝球生物量最大，菌丝球较密、均匀。

本试验与前人相关研究的不同之处，主要体现在以下两个方面：

第一，研究的内容更加完整。本研究内容包含两个方面，即培养液的配方筛选和培养条件的对比试验，以往的研究内容大多比较单一，多数是培养条件的对比试验，关于培养液的配方筛选相对较少。

第二，试验结果有较大的差异。本试验所得的摇床转速、培养基装瓶量、维生素B₁添加浓度、摇前静置时间等草菇液体菌种培养优化工艺条件，与前人相关研究结果不同，孰优孰劣，有待今后进一步探讨。

基金项目

河池市中央引导地方科技发展资金项目(河科ZY230301)，桂西北地方资源保护与利用工程中心(桂教科研[2012] 9号)，河池学院高层次人才科研启动费项目(XJ2018GKQ015, XJ2018GKQ016)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献