1. 引言
近年来我国经济社会的快速发展给自然环境带来了破坏，过度的人类社会活动造成了水体富营养化程度的加重[1]。富营养化进程的加快容易引起水华暴发[2]、生物多样性的减少[3]等一系列生态系统发生变化，严重者甚至影响工农业生产和人类生活。磁湖位于湖北省黄石市黄石港区，汇水面积62.8 km2，地处黄石主城区中心，为典型城中湖，其生态环境复杂，是湖北省重点保护湖泊之一[4]。磁湖流域降雨充足，在黄石市承担着蓄洪防洪、水体生态系统调节的功能[5]。其水体流动性与水体交换能力都较差，磁湖周边人口密集，沿岸分布着50多个建材、冶金、机械、煤炭、纺织、化工、食品等行业多个规模以上企业，长期遭受工业废水以及生活废水的污染[6]。近些年黄石市政府高度重视磁湖的生态环境保护工作，大力推进流域生态建设，切实改善了流域的污染现状[7]。研究发现由于社会经济高速发展形成的环境压力和历史上高强度矿冶生产形成的环境污染等矛盾的交织，使得磁湖水质未从根本上得到好转[8]。
近年来，许多学者通过对特定水域浮游植物的研究用于指示相应水体的水质状况[9][10][11]。浮游植物作为水生生态系统的主要生产者和食物链的基本环节，可以直接反映水环境的变化，包括物种组成、数量分布、优势种和群落特征，因而可以作为水生态系统环境质量的重要指标[12][13]。粒径对群落组成更替等同时存在重要影响。浮游植物的粒径在2~20 μm为微型浮游植物(nanophytoplankton)，粒径小于2 μm为微微型浮游植物(picophytoplankton)[5]。
本研究以黄石市城中湖磁湖为目标湖泊，以微型浮游植物为研究对象，通过高效液相色谱结合化学分类法的特征光合色素分析等手段，从不同时空和粒级角度对磁湖的浮游植物群落结构组成、粒级演替规律、浮游植物与环境因子的相关性关系进行探索。从浮游植物对不同环境因子与营养条件的动态响应，以期获得指示水环境变化的藻类生物标志物。研究结果拟为湖泊的生态环境监测和修复治理提供数据参考和工作基础，同时为湖泊水质的快速监测提供新方法和新思路。
2. 材料与方法
2.1. 采样点分布及采样时间
本研究于2021年4月~2021年12月对磁湖进行现场生态调查，并在春、夏、秋、冬四季进行周年季度性检测采样，共计4次采样，分别设置了10个采样点，采样测站分布详见图1。
Figure 1.Map of sampling sites in Cihu Lake
图1.磁湖采样点分布图
2.2. 浮游植物的分粒级过滤方法
采用有机玻璃采水器采集湖泊表面以下0.5 m处的水样，同时记录采样时间、采样地理坐标、采样温度等现场理化指标。将采集到的水样迅速转入塑料容器中，并用黑色塑料袋包装，使水样处于避光状态运回实验室。水样采集后应在当天完成过滤。
具体操作流程：将水样在孔径大小为200 um的白筛绢上进行初过滤，过滤水样中的泥土、沙子等大颗粒物质，所取水样体积应略多于目标体积，此操作为粗过滤。分别取相应采样点的300 mL水样，采用200 um和20 um孔径的筛绢(过滤20~200 um的小型浮游植物)、5 um孔径的聚碳酸酯滤膜(过滤5~20 um的微型浮游植物)、0.7 um的WhatmanGF/F滤膜(过滤0.7~5 um的微微型浮游植物)进行差值过滤，得到不同粒径浮游植物样品，将滤膜对叠后用吸水纸吸干水分，并用锡箔纸包裹，标记过滤时间和采样点，将滤膜置于−80℃超低温冰箱冷冻保存，直至后续分析[14][15][16]。以下为三种不同粒径的膜：
A：0.7 um~200.0 um
B：20.0 um~200.0 um
C：0.7 um~5.0 um
在此项研究中，利用C膜采集超微型浮游生物样本，并通过差减法(具体计算公式为A − B − C)来区分微型浮游生物的粒度。讨论的微型浮游植物主要分为超微型和微型两个粒径范畴。
2.3. HPLC-CHEMTAX化学分析法测定特征光合色素含量
准备一个黑暗的环境，对样品处理操作需要避光。用注射器抽取乙酸铵，通过针孔滤头打入2 mL EP管中。取出样品膜，用剪刀剪碎放入EP管并直接加入1.5 mLN，N-二甲基甲酰胺溶液，置于−20℃条件下冷藏40分钟后以等比例吸取过滤后的乙酸铵和过滤后的样品溶液，共1 mL，装入色谱瓶中混匀进行HPLC色素分析[17]。此色素提取方法可以改善波峰形状，减少样品的拖尾现象。采用外标法进行校准定量，在建立HPLC色素分析方法时，需要考虑多个因素，包括选择适当的色谱柱、色素提取剂和流动相。这种方法结合了光合色素的定性与定量评估，涉及色素浓度的计算，并探讨了这些浓度与浮游植物丰度之间的相关性。通过使用外部标准进行校准和定量分析，采用梯度洗脱技术和相关的数学公式，以提高分析的准确性[18]，该色素提取技术有效优化了色谱峰的形状并减少了样品的拖尾现象。通过制定一套详细的光合色素与浮游植物的转换协议，可以精准地确定淡水湖泊中藻类群落的组成结构。
详细的HPLC相关条件如表1，为确保实验结果的准确性，实验中的玻璃器皿在使用前均需使用超纯水润洗，并干燥备用。
Table1.HPLC related conditions
表1.HPLC相关条件
条件 |
Eclipse XDBC8柱色谱柱 (3.5 μm, 4.6 × 150 mmAgilent, USA) 流动相A：甲醇：1M乙酸铵 = 80:20 (pH = 7.20) 流动相B：100%甲醇(色谱纯) 流动相C：超纯水 |
采用CHEMTAX软件，依据光合色素浓度计算浮游植物对Chla的相对贡献值[19]。本研究共涉及了8种淡水浮游植物光合色素：岩藻黄素(Fuco)、叶黄素(Lut)、堇菜色素(Viol)、新黄素(Neo)、别藻黄素(Allo)、玉米黄素(Zea)、叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)，7个浮游植物类群：裸藻(Euglenophytes)、甲藻(Dinoflagellates)、隐藻(Cryptophytes)、金藻(Chysophytes)、绿藻(Chlorophytes)、蓝藻(Cyanobacteria)、硅藻(Diatoms)。
2.4. 环境理化指标的测定
本研究所涉及检测的环境因子共有15项，其中溶解氧(DO)、电导率(SPC)、总溶解性固体(TDS)等采用EXO自动分析仪检测，总磷(TP)、总氮(TN)、磷酸盐(P-PO4)、高锰酸盐指数(CODMn)水化学指标的测定方法主要采用国家标准方法《水和废水监测分析方法(第四版)》[20]测定。
3. 结果与分析
3.1. 磁湖环境理化指标的季节性变化分析
磁湖春夏秋冬四季的理化指标变化如表2所示，四季中，水温、磷酸盐、溶解氧、高锰酸盐指数、叶绿素a浓度均为夏季最高。磁湖四季pH变化范围在7.53~9.13之间，呈弱碱性。磁湖秋季pH值最高，最大值出现在6号站点，冬季pH最低，出现在1号站点。秋季浊度与氧化还原电位的值最高。
磁湖四季总磷的变化范围在0.04~0.33 mg/L之间。春季TP含量最低，最小值出现在1、2、3、5号点，均为0.04 mg/L，最大值出现在夏季。磁湖春季的TN/TP平均值为8.21，夏季的TN/TP平均值为10.52，秋季的TN/TP平均值为21.33，冬季的TN/TP平均值为11.64。Chla是水环境浮游植物总生物量的重要指标，与湖泊水环境的营养状态有很强的相关效应。磁湖Chla的变化范围大致在20.76~153 μg/L之间，除磁湖秋季10号点外，其余各站点Chla含量均大于30 μg/L。夏季Chla值最高，但Chla含量最高值在磁湖秋季6号站点。
Table2.Physical and chemical indicators of four seasons in Cihu Lake
表2.磁湖四季理化指标
环境参数parameter |
CHspr |
CHsum |
CHaut |
CHwin |
水温/WT (˚C) |
18.55 ± 0.3 |
31.49 ± 0.42 |
18 ± 0.67 |
10.5 ± 0.97 |
电导率/SPCond |
424.52 ± 37.11 |
343.42 ± 30.65 |
354.1 ± 77.69 |
429.33 ± 59.09 |
溶解氧/DO (mg/L) |
9.53 ± 1.14 |
12.21 ± 1.03 |
10.46 ± 1.53 |
9.52 ± 0.66 |
氧化还原电位/ORP |
354.21 ± 12.52 |
214.94 ± 43.09 |
438.56 ± 25.45 |
325.59 ± 101.21 |
盐度/Sal (psu) |
0.2 ± 0.02 |
0.16 ± 0.01 |
0.17 ± 0.04 |
0.21 ± 0.03 |
总溶解性固体/TDS (mg/L) |
276.1 ± 24.06 |
225.11 ± 20.36 |
229.7 ± 49.32 |
278.7 ± 37.89 |
浑浊度/Turbidity FNU |
17.03 ± 5 |
18.51 ± 7.24 |
21.27 ± 6.29 |
15.69 ± 4.6 |
pH |
8.23 ± 0.22 |
8.93 ± 0.16 |
8.75 ± 0.39 |
8.14 ± 0.61 |
高锰酸盐指数/CODMn(mg/L) |
6.12 ± 0.73 |
9.62 ± 1.1 |
4.95 ± 1.46 |
6.45 ± 0.61 |
磷酸盐/P-PO4(mg/L) |
3.15 ± 0.56 |
8.77 ± 0.69 |
3.9 ± 0.39 |
2.91 ± 0.33 |
总磷/TP (mg/L) |
0.06 ± 0.03 |
0.19 ± 0.06 |
0.09 ± 0.01 |
0.22 ± 0.09 |
总氮/TN (mg/L) |
0.55 ± 0.54 |
1.79 ± 1.6 |
1.93 ± 0.67 |
1.76 ± 1.01 |
透明度/SD (m) |
0.55 ± 0.09 |
0.42 ± 0.1 |
0.42 ± 0.07 |
0.57 ± 0.06 |
叶绿素a/Chla(μg/L) |
58.11 ± 24.5 |
91.63 ± 31.5 |
73.55 ± 39.62 |
43.32 ± 11.31 |
氮磷比 |
8.21 ± 5.32 |
10.52 ± 9.79 |
21.33 ± 7.71 |
11.64 ± 12.39 |
氮磷比 |
8.21 ± 5.32 |
10.52 ± 9.79 |
21.33 ± 7.71 |
11.64 ± 12.39 |
注：CHspr表示磁湖春季站点，CHsum表示磁湖夏季站点，CHaut表示磁湖秋季站点，CHwin表示磁湖冬季站点。
3.2. 磁湖水体水质及富营养化状态评价
如图2所示，磁湖春季整体为轻度富营养化水质，其中9号、10号站点TLI指数最高为60.93和64.75，处于中度富营养化状态。磁湖夏、秋、冬季整体皆为中度富营养化水质，其中夏季8号站点TLI达到70.57，10号站点达到71.95，为重度富营养化状态。磁湖秋季富营养化程度比夏季略低，1、2、3、10号站点为轻度富营养化状态。
注：TLI (∑) < 30为贫营养状态，30 ≤ TLI (∑) ≤ 50为中营养状态，50 < TLI (∑) ≤ 60为轻度富营养状态，60 < TLI (∑) ≤ 70为中度富营养状态，TLI (∑) > 70为重度富营养状态[21]。
Figure 2.Box plot of comprehensive nutrient status evaluation of four seasons in Cihu Lake
图2.磁湖四季综合营养状态评价箱线图
3.3. 特征光合色素组成及时空分布特征
采用HPLC技术对磁湖浮游植物的光合色素组成、含量和时空变化规律进行检测，结果分析，主要有代表性的特征光合色素有八种，分别为Fuco、Neo、Viola、Allo、Zea、Lut、Chla和Chlb。各种色素对应的中文名称如表3所示。
磁湖全年浮游植物特征光合色素分布如图2所示。八种特征型光合色素中，Fuco、Zea、Chla、Chlb在不同季节的时空分布上有很大差异，为磁湖最主要的特征型色素。对磁湖四季各粒级浮游植物的光合色素含量进行比较发现，在几种色素含量中，夏季Chla含量普遍偏高，表明磁湖夏季浮游植物总生物量丰度较高，其次是秋季和冬季。夏季Zea和Chlb含量明显高于其他季节，春季含量最低。
岩藻黄素含量的时空分布如图3(a)所示，其全年的浓度范围大致为：21~993 ng/L，其中冬季微型浮游植物Fuco含量相对较高，春季最低，季度差异明显，在超微型浮游植物中全年含量都较少。紫黄素的含量分布如图3(c)所示，全年的浓度范围大致为：6.2~192 ng/L，主要集中在夏秋季微型浮游植物中，在夏季达到顶峰，春季含量最低。玉米黄素的色素分布如图3(f)所示，其浓度范围大致为：10~1190 ng/L，夏季微型超微型色素含量远超其他季节，春季含量最少。叶绿素b的色素分布如图3(g)所示，其浓度范围大致为：61~1500 ng/L，主要集中在夏季微型浮游植物中，并达到最高值，冬季也略有上升，在超微型浮游植物中主要集中于夏季，但相对含量较少。叶绿素a含量的分布如图3(h)所示，其浓度范围大致为：200~12,000 ng/L，叶绿素a含量在全年都保持在较高水平，秋季含量最高。
Table3.Correspondence between characteristic photosynthetic pigments and phytoplankton
表3.特征光合色素与浮游植物的对应关系
中文名称 |
英文名称 |
简称 |
种类 |
对应藻类群 |
叶绿素a |
Chlorophylla |
Chla |
叶绿素 |
除原绿球藻的所有类群 |
叶绿素b |
Chlorophyllb |
Chlb |
叶绿素 |
绿藻、原绿球藻、青绿藻 |
岩藻黄素 |
Fucoxanthin |
Fuco |
类胡萝卜素 |
硅藻、金藻 |
玉米黄素 叶黄素 |
Zeaxanthin Lutein |
Zea Lut |
类胡萝卜素 类胡萝卜素 |
蓝藻、原绿球藻、绿藻 绿藻、青绿藻 |
紫黄素 |
Violaxathin |
Viola |
类胡萝卜素 |
绿藻、青绿藻 |
新黄素 |
Neoxanthin |
Neo |
类胡萝卜素 |
绿藻、青绿藻 |
别藻黄素 |
Alloxanthin |
Allo |
类胡萝卜素 |
隐藻 |
Figure3.Map of the distribution of characteristic photosynthetic pigments of the phytoplankton in Cihu lake throughout the year
图3.磁湖全年浮游植物特征光合色素分布图
3.4. 磁湖微型浮游植物群落结构及其时空分布特征分析
基于光合色素浓度，通过CHEMTAX软件计算得到的磁湖微型及超微型浮游植物藻类组成如图4、图5所示。总体上，磁湖春季微型浮游植物的绝对优势物种为裸藻，相对丰度占比达到62.26%，其中在7号、8号站点相对丰度皆达到88.59%，隐藻和硅藻也占据一定比例，分别综合占比20%和13.5%。超微型浮游植物的绝对优势物种也是裸藻，达到62.6%，隐藻和硅藻所占比例分别为19.3%和13.2%。夏季磁湖微型和超微型浮游植物优势物种由裸藻变为隐藻，占比达到80%以上，其中3号站点相对丰富度达到97.7%，蓝藻所占比例相对较少，为1%。秋季磁湖微型浮游植物优势物种再次变为裸藻，平均占比达到55.2%，其中5号站点相对丰富度高达97%，隐藻平均占比为18.6%，金藻占比4%，绿藻占比8.6%，蓝藻占比5.1%，硅藻占比8.1%。超微型浮游植物优势物种也变成裸藻，占比53%，隐藻占比19.3%。冬季磁湖微型浮游植物优势种群为裸藻和隐藻，分别占比34.7%和29.8%。金藻占比4%，绿藻占比6.4%，蓝藻占比8.1%，硅藻占比17%。超微型浮游植物优势种群也为裸藻和隐藻，分别为35.1%和30.6%，硅藻占比16.4%。
Figure4.Microphytoplankton composition of the Cihu Lake
图4.磁湖微型浮游植物组成
Figure5.Ultraphytoplankton composition of the Cihu Lake
图5.磁湖超微型浮游植物组成
3.5. 磁湖浮游植物与环境因子的互动关系分析
在湖泊中浮游植物的总生物量一般与Chla成正比，但是环境因子错综复杂，会对浮游植物的生长繁殖产生一定影响。为探究影响城中湖浮游生物群落结构组成的相关环境因素，运用Canoco5软件分别对磁湖不同粒级浮游植物的群落组成与环境理化因子：溶解氧(DO)、电导率(SPC)、总溶解性固体(TDS)、磷酸盐(P-PO4)、总磷(TP)、总氮(TN)、高锰酸盐指数(CODMn)、酸碱度(pH)等进行去趋势对应分析(DCA)。在微型粒级浮游植物与环境因子的分析中，根据轴长的最大值为1.77，小于3.0，选用RDA进行后续分析，通过Canoco5软件对这几种理化环境因子进行前向选择，根据显著性p< 0.05进一步筛选出：CODMn(p= 0.002)，Turb (p= 0.01)，TP (p= 0.022)。将筛选后的环境因子继续与微型浮游植物物种组成进行RDA分析。如图6所示，第一轴解释率为23.5%，第二轴解释率为5.8%。
在进行超微型浮游生物与环境因子间关系的分析时，DCA分析轴长的最大值为1.43，在3.0以下，选用RDA分析。通过前向选择，根据显著性p< 0.05进一步筛选出：P-PO4(p= 0.02)、WT (p= 0.02)、SD (p= 0.02)、SPC (p= 0.014)这几种环境因子，并进行RDA分析。结果如图7所示，第一轴解释率为78.8%，第二轴解释率为2.9%。
结果显示，针对微型浮游植物，Cyanobacteria、Chysophytes、Cryptophytes与CODMn和TP呈显著正相关，Euglenophytes、Dinoflagellates与CODMn和TP呈显著负相关。针对超微型浮游生物，WT与Cryptophytes呈显著正相关与Euglenophytes、Chlorophytes、Chysophytes呈显著负相关，Euglenophytes、Chlorophytes、Chysophytes、Dinoflagellates、Diatoms与SD呈显著正相关，Cryptophytes与SD呈显著负相关。
Figure6.RDA analysis of microphytoplankton and environmental factors
图6.微型浮游植物与环境因子RDA分析
Figure7.RDA analysis of ultraphytoplankton and environmental factors
图7.超微型浮游植物与环境因子RDA分析
4. 讨论
4.1. 磁湖水体富营养化以及与环境因子的关系
参照国家《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)，磁湖水质类别介于IV类~V类之间，TN、TP、CODMn含量超标是磁湖水域重要的生态环境问题。TN虽然不参与地表水断面的考核，但仍影响着水生态环境系统。英美研究者建议静水水体中TP最适浓度分别为0.086 mg/L与0.05 mg/L[22]，磁湖水体TP浓度均比建议值高，已处于富营养化水平。相关研究表明，当水体营养盐TN浓度大于等于0.2 mg/L的阈值时，就会产生水华[23]，而磁湖水体的TN浓度值均超过0.2 mg/L。磁湖春季的CODMn值很低，到夏季较高，到秋冬季略有下降，在RDA分析中，CODMn与磁湖微型浮游植物物种组成具有很强的相关性和高解释度，由此可知，CODMn可能是造成磁湖春季轻度富营养化，到夏秋冬季节中度富营养化程度逐渐由高到低下降的主要原因。
从表1可知，TP在春季含量最低，在夏季含量最高。磁湖春季的TN/TP平均值最低，秋季的TN/TP平均值最高。总体上磷含量的季节分布特征由小到大依次为春季，秋、冬季，夏季。同时磁湖整体在夏季呈现中度富营养化，有些位点甚至达到了重度富营养化，整体上富营养化程度较其他季节重，该结论与其他研究结果相一致[24]。Chla可以有效反映水环境浮游藻类污染情况，相关研究表明当Chla值大于26.2 ug/L时会有水华产生[25]，磁湖Chla含量在2021年全年都保持在较高水平，即磁湖发生了水华。且结果表明Chla可以有效反映水环境浮游藻类污染情况。磁湖出现中度及重度富营养化与夏季Chla含量普遍偏高也有一定关系。
4.2. 浮游植物季节演替规律以及环境因子对群落组成结构的影响机制
研究表明，湖泊浮游植物群落存在明显的季节演替现象[26]。磁湖春季优势种群为裸藻，隐藻和硅藻也占据一定比例；夏季优势物种变为隐藻；秋季浮游植物优势物种再次变为裸藻；冬季的浮游植物优势种群为隐藻和裸藻。
磁湖夏季TP含量最高，此时隐藻为湖泊内优势物种，通过RDA分析显示TP与隐藻成显著的正相关性。由于夏季温度升高，蓝藻等喜温藻类含量上升，与TP呈正相关[27]，这与本研究结果一致。春、秋两季优势种群是裸藻，但隐藻含量也占据一定比例，此时湖泊内TP含量较夏季低，并且通过RDA分析得知TP与裸藻成负相关性。冬季磁湖优势类群为隐藻和裸藻，两者含量占比相差不大，此时湖泊内TP含量也是较夏季低。同时据冗余分析显示，隐藻和裸藻与CODMn同样有很强的相关性：其中裸藻与CODMn呈显著负相关，隐藻与CODMn呈显著正相关。磁湖湖体内优势物种的更替与CODMn也存在着密不可分的关系。
由此可见，浮游植物群落结构组成及分布主要受到水体TP 与CODMn的影响[28]。
4.3. 浮游植物与其他环境因子的互作机制
通过冗余分析得到，TP与CODMn是影响磁湖微型浮游植物群落变化的关键因素，WT与P-PO4是影响磁湖超微型浮游植物群落变化的关键因素。其中WT对浮游植物生长的影响最为直接，WT可直接影响水体中有机营养物质的分解和循环速率，能通过控制浮游植物光合作用与呼吸作用直接限制其生长，WT还能控制浮游植物细胞中酶的活性，直接影响其新陈代谢从而影响生长[29]。TP、CODMn、P-PO4常被作为地表水体受有机污染物污染程度的综合指标，对微型、超微型浮游植物群落结构也有着显著影响。
5. 结论
本研究以城中湖泊磁湖为研究水域，通过对磁湖四季各进行一次采样，展示了四个季节磁湖的营养状态结构、浮游植物群落组成情况、特征光合色素组成、生物量、多样性以及与四季之间的时空异质性。分析了浮游植物群落组成结构与环境因子以及水体富营养化程度之间的相关性。
从浮游植物群落结构来看，磁湖富营养化时，隐藻含量的占比与其他藻类相比，占据了极大的优势。环境因子的变化导致群落结构发生变化，进而引起水体的富营养化程度的改变。从理化因子来看，水体富营养化主要与TP和CODMn有关，同时对环境因子进行冗余分析发现，浮游植物群落的组成分布及生长发育影响，是多个环境因子共同作用的结果。分析结果显示，浮游植物的群落结构在一定程度上可以反映湖泊的水质情况。同时，这些结果揭示了磁湖水质状况、浮游植物的时空变化特征及其影响因素，为浮游植物的生物多样性以及磁湖的生态环境监测提供了基本数据。
致 谢
本次项目的完成，离不开指导老师的帮助与团队合作。感谢侯老师的指导与建议，感谢前辈们提供的帮助，感谢团队成员们的合作帮助，使我们共同完成此项目。
基金项目
本项目为省级大学生创新创业训练计划项目(S202210513054)，国家自然科学基金(41171045)及学校配套项目；感谢国家自然科学基金和省级大学生创新创业训练计划项目基金的支持。
NOTES
*通讯作者。