1. 引言

2020年全球癌症统计报告数据显示，肺癌的发病率、死亡率分别位居全球癌症疾病谱的第2位和第1位 [1] ，临床上确诊的肺癌病例中80%~85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，且大于65%的患者被发现时处于肺癌晚期，预后较差 [2] 。根据NSCLC的病理学特征，可以细分为三个亚型：肺腺癌(Lung adenocarcino-ma, LAD)、肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LSCC)和大细胞癌(large cell carcinoma, LCC)，其中NSCLC的主要类型是肺腺癌和肺鳞癌，分别占NSCLC病人的50%和30% [3] 。目前NSCLC患者的的治疗策略主要集中在手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗以及免疫治疗等方面，根据患者的自身情况制定个体化的综合治疗方案。目前70%的患者在被确诊时已是晚期，且现阶段使用的治疗方法患者5年生存率尚不足15% [4] 。因此，提高患者5年生存率最重要的方法就是提高非小细胞肺癌的早期诊断率。

当前，临床上对于诊断NSCLC的主要手段方法包括X线检查、计算机体层成像(CT)、磁共振成像(MRI)、经支气管针吸活检术和经胸腔穿刺活检术等 [5] [6] 。X线检查可能会造成漏诊，且对病变的确切位置诊断存在一定困难；随着CT技术的日益成熟，对于NSCLC的检出率在逐步提高，但其准确率亟待提升；在MRI图像中无法显示肺的微观结构，并对肺内的钙化病灶不敏感；而经胸腔穿刺活检术并不适用于所有患者，且严重并发症的发生率可达24.45% [7] [8] [9] 。以上检查方法都存在着一定的局限性，因此，亟待寻找能够提高NSCLC检出率和特异性的方法。

由于外泌体(exosome)在细胞通讯中发挥着至关重要的作用，近年来来逐渐成为学者们争相研究的宠儿。非编码核糖核酸(Noncoding RNA, ncRNA)在转录调节、染色体复制、核糖核酸加工和修饰、mRNA的稳定和翻译以及蛋白质的降解和转运等方面具有重大意义 [10] 。因此，外泌体中的ncRNA可能成为早期诊断或提高NSCLC病人5年生存率的潜在标志物。本文将以NSCLC潜在标志物的非编码RNA在外泌体中的研究进展进行综述。

2. 外泌体与外泌体非编码RNA

外泌体是一种大小在30~100 nm之间细胞外膜样的杯状微形囊泡，普遍存在于体液中，主要通过体内大部分种类的细胞分泌，其来源于细胞内部的多泡体，通过胞吐作用后，被释放到细胞外的微环境中 [11] 。外泌体中的细胞成分较多，主要有DNA、RNA、脂类、代谢产物、胞质等，也含有多种细胞表面蛋白 [12] 。现在，主要使用以下七种方法：超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、商品化试剂盒沉淀法、亲和层析法、免疫磁珠法和微流控芯片法对外泌体进行提取和分离 [13] [14] 。表1归纳了几种外泌体分离方法的优缺点。

对外泌体进行鉴别的方法主要有以下三种：应用透射电子显微镜直接观察外泌体的形态，免疫学方法也就是通过流式细胞术、Western-blot、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等实验手段对外泌体表面特异蛋白CD9、CD63进行检测，以及纳米示踪分析技术(NTA) [15] [16] 。

非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)是指信使RNA (message RNA, mRNA)系列上除编码序列以外的其他序列，因此是不能作为翻译模板的非mRNA转录产物 [17] 。经过对非编码RNA形状、长度和功能的研究，学者们将其分为以下三个大类：环状RNA (Circular RNA, circRNA)，长链ncRNA (Long non-coding RNA, lncRNA)及小ncRNA (Small RNA, sRNA)。其中，由外显子–内含子circRNA、外显子circRNA和基因间circRNA组成的环状RNA，由于稳定性高，具有较强的表达特异性和保守性，被赋予较高的临床意义；lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的ncRNA，属于一种数量巨大的非编码RNA，其数量超过了全部RNA的80%；小ncRNA主要由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、微小RNA (miRNA)、与Piwi蛋白相作用的RNA (Piwi-interacting RNA, piRNA)等组成，在转录水平及转录后水平介导基因沉默等方面起着重要作用 [18] [19] [20] 。表2对部分外泌体ncRNA的一些生物学作用进行了归纳总结。

3. 外泌体ncRNA作为非小细胞肺癌生物标志物的研究

外泌体中含有大量可以发挥生物学功能的RNA，其中不具备编码功能的ncRNA数量大、种类多，主要包括：miRNA、lncRNA、circRNA等等。这些外泌体ncRNA可参与细胞相关的几乎所有生理或病理过程，其生物学功能包括抑制或促进肿瘤的生长和转移、参与细胞的分化和代谢等 [21] 。因此，研究外泌体ncRNA的功能，在疾病的预防、治疗、预后等方面具有重要意义。

3.1. 外泌体miRNA (exosomal microRNA, exo-miRNA)与NSCLC

微小RNA (miRNA)被学者定义为长度约19~22个nt的小分子ncRNA，其主要生理功能是参与调控生命的基本过程，比如器官组织的发生、发育成熟等，与此同时miRNA既可以作为抑制肿瘤的因子，也可以作为促肿瘤的因子 [22] 。目前已知的与细胞增殖、分化、凋亡、转移有关的miRNA大约有800~1000种，而与NSCLC癌细胞相关的miRNA约有40种，其中miR-21、miR-210和miR-184是目前已知与NSCLC癌细胞生长密切相关的外泌体miRNA。

miR-21是位于人类第17号染色体区域的微小RNA，高度保守 [21] ，在肺癌、胃癌、膀胱癌等大多数临床上常见的恶性肿瘤中表达异常 [23] 。He等 [24] 人经研究发现NSCLC患者血清中miR-21高表达，其作用机理可能是通过miR-21来抑制细胞的分化，并促使细胞向肿瘤细胞转变，从而提高癌症的发生率。Shen等 [25] 的研究发现，血清外泌体miR-21可通过不同的靶向分子调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。miR-21在NSCLC早期诊断中具有特定的价值，或被认为是NSCLC早期诊断的辅助指标。Li等 [26] 的研究显示，在NSCLC病人的血清中，miR-184的表达比正常人群要高很多，它在区分非小细胞肺癌的良恶性方面具有重要意义，并且与病人的预后有很好的相关性。Yang等 [27] 发现外泌体中的miR-210的表达水平与NSCLC细胞的迁移、增殖、入侵能力以及EMT的增加有明显的正相关，可通过PTEN/PI1K/AKT途径对NSCLC细胞的转移和入侵进行调节。上述研究提示，在NSCLC细胞外泌体中的miRNA可能作为诊断NSCLC的潜在标志物。

3.2. 外泌体lncRNA (exosomal lncRNA, exo-lncRNA)与非小细胞肺癌

LncRNA是一种线性的ncRNA，其长度大多超过200个核苷酸 [19] 。据人类基因数据库Human GENCODE的统计结果显示，人类基因组的lncRNA数量超过16000个。根据lncRNA基因在人类基因组上的定位，可分为5类：1) 位于基因间的一类lncRNA，称为lincRNA (Long intergenicRNA)；2) 反义链lncRNA；3) 正义链lncRNA；4) 位于内含子区的lncRNA；5) 双向lncRNA [28] 。Xian等 [29] 人在血清外泌体中发现一种全新的非编码RNA，即Linc01125。Linc01125能够起到竞争内源性RNA的作用，通过海绵化miR-3b-3p，提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白3 (Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 3, TNFAIP3)表达，从而抑制肿瘤生长和转移。因而血清外泌体linc01125是一种有希望的生物标志物，可用于无创诊断NSCLC和预测NSCLC的预后。Ling等 [30] 的研究显示，NSCLC患者血清中表达LncRNA RP5-977B1的新型外泌体对NSCLC早期诊断敏感性好，具有特异性，临床诊断应用潜力较大。外泌体RP5-977B1水平与NSCLC预后呈负相关，与肿瘤分期和远处转移相关，表明其具有基于血清的预后生物标志物的潜力。Talebi等 [31] 通过评估不同lncRNA在NSCLC患者的肿瘤组织、邻近非癌组织(Adjacent Non-Cancerous Tissue, ANCT)和外泌体中的表达发现，与ANCT相比，lncRNA-GHSROS、lncRNA-HNF1A-AS1和lncRNA-HOTAIR在外泌体的表达显著上调，而lncRNA-HMlincRNA717和lncRNA-P21在外泌体中表达下调，将肺癌特异性lncRNA与以上五种lncRNA组合检测，可提高NSCLC诊断的准确性。

3.3. 外泌体circRNA (exosomal circRNA, exo-circRNA)与NSCLC

circRNA是一种内源性ncRNA，在1976年Hsu等人 [32] 在Hela细胞质中发现了circRNA的表达。Xian等 [33] 在循环外泌体中鉴定出三种circRNA分别是：CIRC_0047921、CIRC_0056285和CIRC_0007761，对NSCLC早期诊断具有重要的意义。该研究发现，CIRC_0047921和CIRC_0056285在NSCLC患者血清中表达量减少，而CIRC_0007761的表达量明显增加。CIRC_004792可区分NSCLC患者和慢性阻塞性肺疾病患者，CIRC_0056285和CIRC_0007761可区分NSCLC患者和肺结核患者。此外，Zhang等 [34] 发现circSATB2在NSCLC细胞和组织中高表达，可能促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并且可能与NSCLC患者的淋巴转移有关。在NSCLC患者血清中，外泌体circSATB2检测的灵敏性和特异性高于非癌性样本，提示circSATB2可作为肺癌和转移性肺癌的外泌体生物标志物。circRNA在外泌体中含量丰富且稳定，在NSCLC早期诊断、预后等方面具有极大的临床前景和应用价值。

4. 外泌体ncRNA检测的应用价值与限制性

目前已有多项研究显示，外泌体ncRNA在NSCLC的早期诊断、治疗及预后中具有不可或缺的作用。NSCLC细胞可向其他细胞分泌含有特定ncRNA的外泌体，从而激活相关信号通路、促进新血管的生成，进而促进癌症的发生发展；其他细胞在接收NSCLC细胞分泌的外泌体同时，也可将外泌体分泌至NSCLC细胞，从而影响癌症的发生发展。外泌体作为遗传物质的有效载体，已成为研究NSCLC发病机制和最新研究技术的有力工具。然而，目前关于外泌体的研究尚存在局限性，首先，外泌体分离及鉴定方法虽然有多种，但每一种都有不同程度的局限，亟待进一步改善；再者，有关外泌体的发生释放等过程尚未完全揭示，对于新提出的分离检测方法还需反复验证、进一步完善；第三，现有的技术还需提高外泌体识别的分辨率、特异性和灵敏性，加速相关临床应用发展；第四，提高外泌体的回收率、降低损失，进一步保证含量高且能大批量分离外泌体。

5. 小结

NSCLC具有较高的发病率和死亡率，目前临床上主流的治疗方法包括化学药物治疗、放射治疗、外科手术、靶向治疗和免疫治疗等综合治疗，但要提高NSCLC患者的5年生存率仍有一定难度。液体活检技术是检测外泌体ncRNA的重要方法，外泌体ncRNA将成为NSCLC早期诊断、治疗及预后的关键生物标志物。尽管外泌体ncRNA与NSCLC的研究得到许多学者的关注，但目前发现的外泌体ncRNA基因仍较少，研究较局限，因此，未来还需要不断探索新的靶点或者标志物来突破NSCLC治疗瓶颈，提高NSCLC患者的生活质量。

致谢

行文至此，落笔为终。从论文的选题、资料的收集到论文的撰写完成，首先要感谢的是我的导师范晓航老师，范晓航老师严谨的治学态度和渊博的学识对我影响深远，笔短情长，师恩难忘！同时还要感谢我的朋友们，在学习工作中见证了我的喜怒哀愁，敬友谊长存，不离不弃，各自努力，高处相见。

基金项目

湖北省教育厅中青年人才项目(Q20182603)，湖北文理学院大学生创新创业项目(202110519007、X202110519015、X202310519068)，湖北文理学院博士科研启动经费资助项目(2059201)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。

参考文献