1. 引言

肝细胞癌(HCC)是肝癌中比较常见的一种，其病情进展迅速，恶性程度很高，且起病隐匿，大多数患者早期无症状和体征，多数患者确诊后生存期仅有3~6个月 [1] [2] [3] 。肝细胞癌的癌症死亡率很高，居全球范围内前列 [4] [5] 。HCC发生发展的主要因素包括肝硬化，病毒性肝炎，黄曲霉素和化学致癌物等 [6] [7] ，其中乙肝病毒(HBV)的感染是其发病的重要因素 [8] ，尤其是在东亚地区。根据IDF癌症数据统计显示，中国每年报告新发肝癌病例约为39.2万例，死亡人数约为34.1万人，占全球总死亡人数的50%以上。在东亚地区，约有90%的肝癌患者和70%以上的乙肝病毒感染者有关。乙肝病毒携带者的肝癌发病率是普通人的几倍。据WHO数据显示，乙肝病毒携带者患肝癌的比例为10%~25%，而不是携带病毒的人中只有0.1%。在中国，约6000万~8000万人是HBV携带者，占该国总人口的10%~15%。而在台湾地区，超过三分之一的人口是HBV携带者。在香港地区，HBV的携带率为8.3%。对于HBV携带者，如果不及时进行有效的治疗，大约有15%~25%会发展成为肝硬化和/或肝癌。因此，对于感染HBV的人群，及时进行预防、监测和治疗，是降低肝癌发病率的关键。虽然早期肝细胞癌的手术治疗效果较好 [9] ，但患者术后五年生存率仅50%~70% [10] [11] [12] 。对于中晚期HCC患者的治疗多采用放射治疗，药物治疗和免疫治疗等 [13] [14] ，但是效果并不理想，因此寻找潜在的治疗靶点具有重要的研究意义。本研究旨在利用公共数据库GEO数据库和TCGA数据库进行数据挖掘分析，我们分别对肝癌组织和癌旁组织进行差异表达分析，寻找肝细胞癌的潜在治疗靶基因，为疾病的预防，诊断和靶向治疗提供新的途径和方向。

2. 材料和方法

2.1. 数据来源

数据来源于癌症基因图谱(the cancer gene atlas, TCGA)数据库，GEO公共数据库，GEO数据集为GSE29721 [15] ，GSE84402 [16] 。TCGA数据库包括374例HCC组织样本，50例癌旁组织样本，本研究纳入374例HCC样本及50例癌旁组织样本，GSE2921是基于GPL570平台，该芯片包括10例HCC组织样本，10例癌旁组织样本；GSE84402是基于GPL570平台，该芯片数据包括14例HCC组织样本，14例癌旁组织样本。本研究纳入398例HCC组织样本及74例癌旁组织样本。所有数据分析均使用R软件(4.0.1)完成。

2.2. 数据集筛选和差异表达分析

剔除TCGA数据集中临床信息不完整及缺乏随访资料的样本，仅保留同时包含临床参数和生存数据的样本，获得每个样本的表达举证并利用R软件的“limma”包，以|logFC| > 1，P < 0.05为条件，筛选出HCC组织中和癌旁组织中的DEGs，并绘制Venn图取交集。其中筛选出的NUF2基因，使用pheatmap包，以|r| > 0.5，P < 0.05为条件，筛选NUF2表达显著相关的基因；以NUF2表达中值为界限，分为NUF2低表达组和NUF2高表达组，对NUF2相关基因进行聚类分析，获得聚类热图。

2.3. PPI网络构建及关键(Hub)基因分析

利用STRING数据库对HCC中上调和下调基因绘制蛋白间交互网络(PPI)，并以TSV格式导出数据，再将得到的源文件导入cytoscape软件，使用插件NetworkAnalyzer，cytoHubba进行关键(Hub)基因的筛选，选用MCC算法，得分前10的基因选取为Hub基因。

2.4. DEGs的GO富集分析和KEGG分析

基因本体论(gene ontology, GO)是注释基因及其产物的重要方法和工具，对整合和利用生物数据具有重要意义。利用DVID数据库，基于R语言的“ClusterProfiler”包，对DEGs进行GO和KEGG通路富集分析，获取差异基因在细胞组分(CC)，分子功能(MF)，生物过程(BP)三个层面的GO富集分析，以及通过KEGG数据库获得差异基因相关的通路富集分析。显著性基因富集的临界值设定为P < 0.05。

2.5. NUF2在HCC中的表达分析

使用TIMER2.0数据库，展示NUF2_TCGA中多种癌症和癌旁的表达情况，展示NUF2在HCC组织中与HCC癌旁组织的表达情况。

2.6. 生存分析与临床相关性分析

根据样本中NUF2基因表达的中位值将NUF2分为高表达和低表达两组，运用R软件的“survival”包进行生存分析，采用“survmine”包绘制生存曲线及ROC诊断曲线。将年龄按>60岁和≤60岁分为两组，分析NUF2的表达与年龄的相关性。将肿瘤T分期分为T1，T2，T3，T4期，并分析NUF2的表达与肿瘤T分期的相关性。

2.7. NUF2和HCC免疫浸润相关性分析

利用仙桃学术工具及TIMER数据库分析NUF2的表达与HCC免疫浸润的相关性。

3. 结果

3.1. 差异表达分析

对TCGA，GSE29721，GSE84402数据集的DEGs进行标准化处理，最终以R语言的Venn包进行结果可视化，经过差异表达分析，分别获得肝癌中42个上调和137个下调差异基因。见图1。

3.2. PPI网络构建及关键(Hub)基因分析

根据差异表达基因进行PPI网络构建及hub基因分析，取前10个hub基因：CDC20，RAD51AP1，RRM2，TTK，NUF2，NDC80，CCNB1，KIF11，UBEC2，BUB1B见图2。

3.3. GO分析和KEGG分析

采用DVID数据库对43个上调基因和137个下调基因进行GO分析和KEGG富集分析，结果表明：差异表达基因在BP上主要富集于carboxylic biosynthetic过程和organic acid biosynthetic过程，在CC上主要富集于spindle，blood micropaticle和midbody，在MF上主要富集于iron ion binding，oxidoreductase activity，acting on paired donors，with incorporation or reduction of molecular oxygen。在KEEG通路上，上调基因主要富集于Cell cycle，Oocyte meiosis和P53 signaling pathway上，下调基因主要富集于Retinol expression和Chemical carcinogenesis。见图3。

3.4. NUF2在HCC中表达情况

使用TIMER2.0数据库分析显示，相比于癌旁组织，NUF2在多种癌症组织中高表达，且相比于HCC癌旁组织，NUF2在HCC组织中高表达。经Oncomine数据库分析显示，NUF2在HCC组织中高表达，且已有2个研究证明NUF2在HCC中表达上调。见图4，图5。

3.5. NUF2生存分析及临床相关性分析

经生存分析显示，高表达NUF2组患者生存期显著短于低表达NUF2组(P < 0.001)，且NUF2 ROC曲线下面积 = 0.983，对HCC具有极大的诊断价值。进行临床相关性分析显示，年龄越大，NUF2越高表达，临床T分期越高，NUF2表达越高。见图6，图7。

3.6. NUF2的表达与HCC免疫浸润关系

经仙桃学术与TIMER数据库分析显示，NUF2的表达与Th2，T辅助细胞，B细胞，树突状细胞免疫浸润显著相关(P < 0.001)，且与PD1表达显著相关(P < 0.001)，与PD-L1表达相关性较弱。见图8。

4. 讨论

尽管针对HCC的研究已经取得了令人瞩目的成绩，但用以阐明HCC易感性、进展和预后的潜在分子机制的相关基因尚未确定。也就是说，针对与HCC患者预后不良相关的直接调控机制的新疗法仍需确定 [17] [18] [19] 。目前，手术切除仍是剩余肝功能良好的患者的主要治疗选择。不幸的是，复发的风险非常高，5年肿瘤复发率高达70% [20] ，强调了准确精准治疗的迫切临床需要，以提高肝癌患者的生存率。

尽管在HCC微阵列数据集中，一些肿瘤特征显示与肿瘤复发显著相关 [21] [22] ，当这些定性临床参数在不同的中心被记录时，在其他独立数据集中很少观察到这种相关性，这些数据集显示了高度的可变性和由此产生的低重现性。文献证据表明 [17] [23] ，早期复发的肿瘤可能与原发肿瘤的转移特性有关，一项研究对995例行肝切除手术的肝癌患者进行随访，发现早期复发的肝癌病例中，约有70%的病人切除前存在血管瘤样结构，也就是在肿瘤周围存在微小的癌细胞群，这些癌细胞可以通过静脉、淋巴管扩散到周围组织和器官导致早期复发。晚期复发的肝癌则可能是新发肿瘤的结果。一项研究对311例肝癌患者进行随访，发现晚期复发的肝癌病例中，约有66.4%的患者出现了新的肝癌病变，并非原来肿瘤的再生长或转移所致。此外，患者的肝功能状态、术后生活方式等因素也可能对晚期复发的发生起到影响。因此，对于肝癌的复发治疗，应根据早期和晚期的不同成因采取不同的治疗策略。在早期复发的治疗中，需要注意预防血管瘤样结构的形成，减少肝切除手术对肝功能的影响；在晚期复发的治疗中，则需要寻找肝癌的新病变，并对新病变进行及时的治疗。在本研究中，我们选择了3个公共微阵列数据集，根据纳入标准，在398个HCC样本和74个非砷样本中筛选除了43个上调DEGs和137个下调DEGs。利用DEGs的PPI网络识别枢纽基因，我们确定了10个hub基因：CDC20，RAD51AP1，RRM2，TTK，NUF2，NDC80，CCNB1，KIF11，UBEC2，BUB1B。然后基于DVID数据库，通过GO和KEGG分析，注释DEGs的功能。最后我们选择了1个潜在的治疗靶点NUF2进行后续分析。据报道，NUF2在HCC细胞生长中具有重要的功能 [24] 。依据我们的研究，NUF2在肝癌中表达上调。多因素logistic回归表明，NUF2是可以成为HCC早期的治疗靶点 [12] [25] 。我们进一步测试了NUF2是否与临床病理参数相结合能够更好地作为潜在治疗HCC的靶点。通过生存分析发现，高表达NUF2组的患者生存期显著低于低表达NUF2组患者。且根据NUF2进行预测HCC的生存期，预测灵敏度很高。总之，我们系统地比较了HCC组织样本和HCC癌旁组织样本中NUF2的表达差异，并分析其与临床的相关性。我们进一步测试和验证了NUF2可成为HCC治疗的靶点，这对于优化HCC患者的治疗方案是非常重要的。

NUF2属于有丝分裂的关键分子，可以影响细胞有丝分裂的进程，与肿瘤的发生和发展也有密切的关系。一些研究表明，NUF2在肿瘤组织中的表达水平较正常组织中显著升高，因此被认为是可能的肿瘤标志物。在临床应用方面，NUF2可以作为一种潜在的肿瘤诊断和预测生存的标志物。例如，在许多癌症的研究中，NUF2的表达水平与肿瘤的分子亚型和生存率有关。因此，在临床上检测NUF2的表达水平可以帮助医生诊断和预测患者的疾病进展。此外，NUF2还被认为可能是一种适合于肿瘤治疗的靶标。一些研究表明，通过靶向抑制NUF2，可以有效地抑制肿瘤生长。这意味着NUF2在临床上可能成为一种治疗肿瘤的可行靶点。总的来说，NUF2在肿瘤的诊断、预测和治疗方面具有潜在的临床应用价值，但需要进一步的研究来证实其具体的应用前景。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献