摘要: 目的：研究昆明市育龄人群地中海贫血基因携带率、基因突变类型等遗传学特征。方法：应用高通量测序技术对在本院就诊的育龄妇女及其配偶进行地中海贫血基因检测。结果：在7254例受检者中，共检出阳性515例，阳性率为7.1%。其中，α-地贫携带者检出333例(64.7%)，人群携带率为4.6%；β-地贫携带者检出119例(23.1%)，人群携带率为1.64%；α-地贫复合β-地贫检出23例(4.5%)，异常血红蛋白变异类型检出20例(3.9%)，其他变异类型检出20例(3.9%)。α-地贫基因以-α3.7/αα缺失型为主，共检出177例；β-地贫基因以Hb E beta+杂合突变为主，共检出41例。通过高通量测序技术，检出罕见α-地贫变异类型72例，罕见β-地贫变异类型12例。结论：昆明地区地中海贫血基因突变类型多样，通过高通量测序技术能够有助于检测出较为罕见的基因突变类型，丰富当地的地中海贫血基因数据库，对地中海贫血的预防和控制具有积极作用。
Abstract: Objective: To analyze the genetic characteristics of the gene carrying rate and gene mutation type of thalassemia in reproductive age population in Kunming. Methods: High-throughput sequencing technology was used to detect tha-lassemia genes in women of reproductive age and their spouses in this hospital. Results: Among 7254 cases, 515 cases were detected positive, the positive rate was 7.1%. Among them, 333 cases were classified as α-thalassemia (64.7%), and the carrying rate was 4.6%. 119 cases were β-thalassemia (23.1%), and the carrying rate was 1.64%. There were 23 cases (4.5%) of α-thalassemia complex β-thalassemia, 20 cases (3.9%) of abnormal hemoglobin variants, and 20 cases (3.9%) of other variants. α-thalassemia genes were mainly -α3.7/αα-deletion genes, and 177 cases were detected. Hb E beta+ heterozygous mutation was dominant in β-thalassemia gene, and 41 cases were detected. 72 cases of rare alpha-thalassemia variant and 12 cases of rare β-thalassemia variant were detected by high-throughput sequencing technology. Conclusions: There are various types of thalassemia gene mutations in Kunming area. High-throughput se-quencing technology can detect rarer gene mutation types and enrich the local thalassemia gene database, which plays a positive role in the prevention and control of thalassemia.
1. 引言
地中海贫血(Thalassemia，简称地贫)是一类由珠蛋白基因缺陷(缺失、突变)导致的遗传性溶血性疾病，是全球分布最广、受累人群最多的一种单基因遗传病。我国长江以南的广东 [1] 、广西 [2] 、贵州 [3] 和云南 [4] 等省是地中海贫血的高发地区。据调查，我国约有地贫基因携带者3000余万人 [5] 。地中海贫血为常染色体隐性遗传病，如果夫妻双方是同型的地贫基因携带者，则生育重型地贫患儿的风险增加 [6] 。此外，地贫基因携带者往往有不同程度的贫血症状，妊娠可加重贫血的程度，甚至会导致一系列与贫血相关的产科并发症 [7] 。因此，提高公众对地中海贫血疾病的认知和开展育龄人群的地贫基因筛查是地中海贫血防控的重要措施。
本研究旨在通过高通量测序技术对昆明地区育龄人群进行地中海贫血基因携带情况的调查分析，为育龄人群地中海贫血的诊断、遗传咨询以及产前诊断提供理论依据和指导。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
选取2020年1月至2022年11月在我院就诊的育龄妇女及其配偶共7254例为研究对象，其中男性3589例，女性3665例。受检者均无血缘关系，近半年内无输血史。经门诊医生充分宣教后，所有受检者均签署知情同意书。本研究受到昆明安琪儿妇产医院医学伦理委员会的监督(伦理批准号为：ANGGYY 2019120305)。
2.2. 方法
2.2.1. 样本采集
用EDTA抗凝管采集受检者外周血3 ml送检。
2.2.2. 基因检测和数据分析
采用Gap-PCR结合高通量测序技术对样本进行α-及β-珠蛋白基因检测。外周血样本经磁珠法提取和纯化基因组DNA、DNA片段化、PCR扩增、末端修复、连接文库接头、文库定量等步骤，最后进行高通量测序。测序数据结合生物信息学分析软件进行自动化分析。检测范围包括4种α-地中海贫血缺失型(--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI)、3种β-地中海贫血缺失型(Chinese Ggamma (Agammadeltabeta) 0、SEA-HPFH、台湾型)、超过153种α-地中海贫血突变型以及超过348种β-地中海贫血突变型。
3. 结果
在送检的7254例样本中，共检出地中海贫血基因携带者515例，携带率为7.1% (515/7254)。其中，α-地贫携带者检出333例(64.7%)，人群携带率为4.6%；β-地贫携带者检出119例(23.1%)，人群携带率为1.64%；α-地贫复合β-地贫检出23例(4.5%)，异常血红蛋白变异类型检出20例(3.9%)，其他变异类型检出20例(3.9%)。
3.1. α-地中海贫血基因类型
在333例α-地中海贫血阳性样本中，检出缺失型4种，非缺失型8种，其中αα/-α3.7基因型最为常见，为177例(53.15%)，见表1。
Table 1. The mutation types and constituent ratio of α-thalassemia gene
表1. α-地中海贫血基因突变类型及构成比
3.2. β-地中海贫血基因类型
在119例β-地中海贫血阳性样本中，共检出16种基因变异类型，包括14种突变型和2种缺失型，见表2。
3.3. α-复合β-地中海贫血基因类型
检出23例α-复合β-地贫携带者。其中，αα/-α3.7复合Codons 41/42 (-TTCT) beta0杂合子7例；αα/-α3.7复合Hb E beta+杂合3例；αα/--SEA复合Codon 17 (A > T) beta0杂合子2例；αα/--SEA复合Codons 41/42 (-TTCT) beta0杂合子2例；Hb Constant Spring复合Codon 17 (A > T) beta0杂合子2例；Hb E beta+杂合复合α珠蛋白三联体αααanti3.7杂合子2例；Hb Westmead复合Hb E beta+杂合子1例；Codons 41/42 (-TTCT) beta0
Table 2. The mutation types and constituent ratio of β-thalassemia gene
表2. β-地中海贫血基因突变类型及构成比
复合α珠蛋白三联体αααanti4.2杂合子1例；αα/-α3.7复合Codon 17 (A > T) beta0杂合子1例；αα/-α3.7复合α珠蛋白三联体αααanti3.7杂合子1例；Hb E beta+复合α珠蛋白三联体αααanti3.7杂合子1例。
3.4. 异常血红蛋白
检出20例异常血红蛋白变异携带者，涉及16种基因变异类型，包括Hb Beijing (HBA2:c.51G > T)杂合，Hb Bushey (HBB:c.367T > C)杂合，Hb G-Coushatta (HBB:c.68A > C)杂合，Hb Groene Hart (α1)杂合，Hb G-Taipei (β)杂合，Hb Hekinan II (α1)杂合，Hb I (α1)杂合，Hb Izmir (β)杂合，Hb J-Wenchang-Wuming (HBA1:c.34A > C)杂合，Hb Kempten (HBA1:c.110T > A)杂合，Hb Nanchang (HBA2:c.46G > A)杂合，Hb New York (HBB:c.341T > A)杂合，Hb New York (β)杂合，Hb Owari (α1)杂合，Hb San Bruno (β)杂合，Hb Gibbon (β)杂合。
3.5. 额外检出的其他变异类型
检出20例HBA1、HBA2和HBB基因的新发变异，其致病性目前尚不清楚。
4. 讨论
地中海贫血是我国南方地区最常见的单基因遗传病之一。地贫基因携带者往往有不同程度的贫血症状，女性携带者孕期可能加重贫血的程度，甚至发生与贫血相关的产科并发症，危害母亲健康，同时由于孕妇血液中血红蛋白浓度降低，可能导致胎儿宫内生长受限甚至死胎。若夫妻双方均为同型地贫基因携带者，则可能生育重型地贫患儿。重型α地贫，常在宫内死亡或分娩后半小时内死亡；重型β地贫患儿多在出生后3~6个月发病，需终生输血治疗，给社会和患病家庭带来深重的负担 [8] [9] 。因此，对育龄人群进行地中海贫血的筛查和诊断是保障母婴健康、改善围产儿结局的关键措施。
目前普遍采用的地贫基因检测技术包括跨越断裂位点PCR (Gap-PCR)、基因芯片等，检测范围存在局限性，检出率低。随着测序技术的快速发展以及检测成本的不断下降，高通量测序技术在地中海贫血的筛查和诊断方面得到了越来越广泛的应用。高通量测序技术成本可控，检测周期短，覆盖位点全面，可对地贫基因序列的所有变异位点进行检测，因此不仅能够检出常见地贫基因，而且在新发变异和罕见变异检测方面有很大优势 [10] [11] [12] [13] 。
本研究共检测出罕见变异类型84例，占地贫阳性样本的16.3%，共涉及15种型别，其中4例IVS-I-1 (AGGT > AGAT) donor杂合，1例IVS-I-38 (C > T)杂合，2例Hb Phnom Penh杂合，32例α珠蛋白三联体αααanti3.7，33例α珠蛋白三联体αααanti4.2，1例中国型Gγ + (Aγδβ) 0缺失杂合，1例台湾型缺失杂合，1例-102 (C > A) beta+杂合，1例-88 (C > T) beta+杂合，1例3'UTR +129 (T > A) beta++杂合，1例IVS-I-13 (G > T) beta (0 or + unclear)杂合，4例VS-II-63 (T > C) beta (0 or + unclear)杂合，2例IVS-II-726 (A > G) beta+杂合。本研究检出的α-珠蛋白三联体为65例，占0.89%。大部分观点认为，α-珠蛋白基因拷贝数增加使α-珠蛋白肽链和β-珠蛋白肽链之间的比例不平衡，因此大多数β-地贫变异复合α-珠蛋白三联体的患者表型为中重度贫血。但也有报道证明，β-地贫变异复合α-珠蛋白三联体携带者没有出现贫血迹象。2021年伊朗一项研究，在67名β-地贫变异复合α-珠蛋白三联体的患者中，只有4名的血红蛋白低于90 g/L，且没有需要定期输血的患者 [14] 。因此，对β-地贫变异复合α-珠蛋白三联体如何进行遗传咨询具有很大的挑战。
本研究采用Gap-PCR结合高通量测序技术对昆明地区育龄人群进行地中海贫血基因的检测。研究表明，昆明地区育龄人群地贫基因携带率较高，变异类型丰富，通过高通量测序发现了较多的罕见变异类型，对丰富本地地贫基因数据库以及地中海贫血的精准防控具有重要意义。
参考文献