1. 引言
载脂蛋白E (Apolipoprotein E, ApoE)参与机体血脂的运输、存储和排泄，具有重要的生物学功能，其编码基因存在两个主要的功能性SNP即c.388T > C (rs429358)和c.526C > T (rs7412)，它们构成3种单倍型，分别是E2 (388T-526T)、E3 (388T-526C)、E4 (388C-526C)。3种单倍型构成6种不同的基因型即E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4 [1]。研究表明，ApoE基因多态性与阿尔茨海默症 [2] [3] [4]、心血管疾病 [5] [6] [7] 及他汀类降脂药的个体化用药 [8] [9] [10] 都有密切关系。尽管现有多种SNP检测方法可用于ApoE基因分型，但测序是业内一致公认的金标准。本研究旨在建立一种通过直接PCR获得ApoE基因靶片段用于桑格法测序的方法，以期为临床和相关基础研究服务。
2. 实验材料和仪器
2.1. 试剂
引物由北京擎科生物科技有限公司(广州)合成；聚合酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA Marker I购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；测序委托北京擎科生物科技有限公司(广州)完成。
2.2. 样本
采自广东药科大学本科生志愿者，均签署知情同意书，按照本实验室的样本处理流程处理后备用。
2.3. 主要仪器
2720型基因扩增仪(美国ABI公司)，DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统(英国Syngene公司)，5804 R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司)等。
3. 实验内容
3.1. 引物设计
根据GenBank中ApoE基因序列信息(登录号：NG_007084.2)及rs429358、rs7412两个多态位点的序列信息，采用引物设计软件初筛引物，再人工加以修改，设计的3条引物P1、P2和P3见图1，其中P1序列与相应的框中序列一致，P2、P3与相应的框中序列反向互补。
P1、P2引物对扩增获得的PCR产物可以作为模板，用P1、P3引物对进行扩增，获得的靶片段同时囊括rs429358、rs7412两个多态位点。
Figure 1. Schematic diagram of primers for amplifying two polymorphic loci of ApoE gene
图1. 扩增ApoE基因两个多态位点的引物示意图
3.2. PCR扩增
3.3. PCR产物鉴定
用胶染法制备含溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶，取4 μL第二轮PCR产物于150 V电泳30 min，用紫外透射仪观察结果，并拍照保存。
3.4. PCR产物的序列测定
将上述第二轮扩增成功的PCR产物委托北京擎科生物科技有限公司测序，测序引物为前述的引物P3。
4. 实验结果
4.1. PCR产物的电泳鉴定
图2的1~5号分别为5个不同样品的PCR产物电泳条带，条带单一，与预期产物片段大小(585 bp)相符，表明PCR取得成功。
M：DNA分子量标记Marker I，1~5为不同样本的PCR产物。
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of the semi-nested PCR products
图2. 半巢式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
4.2. 基因测序结果
ApoE基因rs9263726位点附近的序列为……acgtgYgcggc……，rs7412位点附近的序列为……agaagYgcctg……，图3的测序峰图不仅能清晰地显示这些序列，而且能准确地判断基因型，rs9263726位点基因型为TT，rs7412位点基因型为CT，两者综合起来为E2/E3基因型。
Figure 3. Sequencing peak map of two polymorphic loci of ApoE gene
图3. ApoE基因两个多态位点的测序峰图
5. 讨论
ApoE基因分型目前在基础和临床研究领域具有广泛的需求，其分型方法种类繁多，有的操作复杂，有的需要贵重仪器，有的成本很高，不一而足。
本研究采用直接PCR结合测序的方法进行ApoE基因的分型，具有以下几个特点：
1) 直接PCR意味着PCR使用的模板不需要提纯的DNA，而常规的ApoE基因分型在DNA提取环节往往需要从静脉血中分离白细胞，然后提纯其DNA作模板 [11] [12]，本研究采用半巢式PCR技术，第1轮PCR直接以口腔上皮细胞为模板，节约了提取基因组DNA的时间成本和经济成本，此外，不涉及抽血，采样无创依从性好，且节约了相关的耗材。
2) ApoE基因GC含量非常高，而高GC含量DNA的PCR扩增困难重重学界已达成共识 [13] [14]。其难点在于模板DNA形成的二级结构比较难变性，94℃下可能变性不完全；退火时引物与模板不能很好地结合，容易形成错配；延伸过程也不能很好地进行，从而使扩增效率大大降低 [15] [16]，因此对PCR反应条件进行优化十分费劲。本研究前期使用一些常规的PCR Master Mix进行实验，根本无法获得扩增产物，后来选用了一款名为GC-rich PCR Master Mix的扩增预混液，它包含DNA polymerase、dNTP、MgSO4，GC-rich PCR buffer and stabilizers，只需加入模板、引物和水就能建立反应体系。本研究在反应体系中使用引物对P1、P2和口腔上皮细胞进行PCR时，尽管大部分情况下能获得目的条带(不妨用P1P2表示)，但产量明显不足，因为使用如此粗放且高GC含量的模板，PCR产物的产量不足自然在情理之中。为了解决这个问题，使用了一条代号为P3的引物，它与P1组合使用，利用P1P2做模板进行第2轮扩增即所谓的半巢式PCR，半巢式PCR不仅大幅提高了PCR效率而且还提高了PCR扩增的特异性。
3) 由于引物设计的巧妙，本研究用于测序的PCR产物包含两个SNP位点，即一个测序反应可以获得2个SNP位点的序列信息，既提高了测序环节的效率，又节约了经济成本。
6. 结论
本研究使用简便易得的口腔上皮细胞作为模板直接进行半巢式PCR获得包含ApoE基因两个主要多态位点的靶片段，该靶片段可以用于桑格法测序鉴定样品的ApoE基因型，在临床检测和相关的基础研究上具有良好的应用前景。
基金项目
广东药科大学2020年线上线下混合式一流本科课程立项建设项目；广东省2019年大学生创新训练项目(编号：S201910573042)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。