1. 引言
胃癌目前是全球第六大常见癌症类型和第五大癌症死亡原因，该疾病具有高发病率和高死亡率的特点 [1]。分子生物学已成为胃癌研究的中心领域，肿瘤微环境对肿瘤的发生发展起着关键作用，其中肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages TAMs)正逐渐引起人们的关注。
巨噬细胞是天然免疫反应的参与者，也是实体瘤中白细胞浸润的主要成分。巨噬细胞最初被发现参与抗肿瘤免疫，然而，越来越多的临床前和临床证据表明，TAMs还可以增强肿瘤的发展和转移能力 [2] [3]。在胃癌的发展过程中，大量外周血单核细胞被吸引到肿瘤间质中并被激活成TAMs，TAMs可分为M1型TAMs和M2型TAMs，进展期胃癌中浸润的TAMs常表现为抑制免疫的M2亚型，并在肿瘤的侵袭、转移和血管生成中起着关键性的促进作用 [4] [5]。CD163被认为是M2型巨噬细胞的高度特异性受体 [6]。
炎症是癌症的特征之一 [7]，在胃癌中幽门螺杆菌或其他病原体的感染导致的慢性炎症会削弱M1巨噬细胞的反应，使其处于类M2状态，并增加ROS诱导的巨噬细胞凋亡率，从而增加疾病进展风险 [8]。包括胃癌在内的几种恶性肿瘤中，M2型巨噬细胞密度高者生存较差。M2型巨噬细胞在印戒细胞癌和粘液腺癌中水平较低，而在低分化腺癌中水平较高 [9]。Meta分析显示浸润的M2巨噬细胞数可能是胃癌患者的负面预后因素 [10]。
人类表皮生长因子受体-2 (HER-2)的发现为胃癌患者带来了新的治疗手段。HER-2阳性患者的靶向治疗药物为曲妥珠单抗，TOGA III期随机试验比较了胃或胃食管交界处腺癌患者单独应用化疗或化疗联合曲妥珠单抗治疗的总生存期，研究结果表明曲妥珠单抗联合化疗与单独化疗相比，OS显著增加(13.8 vs. 11.1个月；P = 0.0046) [11]。Lindsten T.，Hedbrant A.，Ramberg A.等人的研究表明在乳腺癌患者中，肿瘤相关巨噬细胞的水平与HER-2的表达无相关性 [12]。然而，在胃癌这一癌种中，HER-2与TAMs的相关性分析的研究尚未有明确结果，本研究旨在分析HER-2表达与M2型肿瘤相关巨噬细胞特异性受体CD163的表达是否存在相关性，以及CD163对胃癌术后患者预后的影响。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
收集2013年1月至2019年12月在青岛大学附属医院接受胃癌手术的患者临床资料，随机选取术后病理为腺癌的患者60例。纳入标准为：术前、术后均未行辅助治疗(放化疗)，FISH检测结果为HER-2基因扩增的患者30例，HER-2基因不扩增的患者30例。
2.2. 随访
对所有纳入研究的患者进行随访，患者总生存时间定义为自手术日期开始至随访日期截止，即截止至2020年04月25日。随访期间患者死亡的总生存时间为手术日期开始至死亡日期截止。
2.3. 实验方法
2.3.1. 实验步骤
1) 切片脱蜡水化：将石蜡包埋组织块进行连续切片，厚度约4 um。切片经二甲苯脱蜡5 min * 3次，放入无水乙醇中水化5 min * 2次。于95%乙醇水化5 min、70%乙醇水化5 min和50%梯度的乙醇水化5 min，自来水冲洗3 min，蒸馏水冲洗2 min * 2次，随后PBS缓冲液冲洗2 min * 3次。
2) 抗原修复：将组织玻片置入抗原修复液(PH = 6)，加热修复20 min。蒸馏水冲洗2 min * 2次，PBS缓冲液冲洗5 min * 3次，3%过氧化氢浸泡10 min，蒸馏水冲洗2 min * 2次，PBS缓冲液冲洗5 min * 3次。
3) 滴加一抗：加入CD163单克隆抗体，37℃放置1小时，PBS缓冲液冲洗5 min * 4次。
4) 玻片加入二抗，37℃下30 min，继续PBS缓冲液冲洗5 min * 4次。玻片加入3,3-二氨基联苯胺(DAB)常温显色(红色)，显色时间约1 min，自来水冲洗2 min。
5) 复染与封片：用苏木素染色，自来水冲洗5 min。用于50%的乙醇水化2 min、70%的乙醇水化2 min和95%的乙醇水化2 min，无水乙醇水化2 min * 2次。二甲苯2 min * 2次透明化处理，中性树胶封片。
2.3.2. 主要试剂
(1) 一抗CD163单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)
(2) 二抗PV-6002 (中杉金桥生物有限公司)
(3) DAB显色试剂盒(中杉金桥生物有限公司)
(4) PBS缓冲液(中杉金桥生物有限公司)
(5) 枸橼酸盐(中杉金桥生物有限公司)
(6) 二甲苯(双双化工有限公司)
(7) 无水乙醇(双双化工有限公司)
(8) 苏木素(中杉金桥生物有限公司)
(9) 中性树胶(中杉金桥生物有限公司)
(10) 过氧化氢(中杉金桥生物有限公司)
2.3.3. 主要仪器
(1) 显微镜：奥林巴斯CX31
(2) 温箱：精宏GMP-9050
(3) 摄像头：TOUPCAM TP10000A
(4) 脱水机：Leica ASP300S
(5) 包埋机：Leica EG1150H
(6) 切片机：Leica RM2235
2.4. 免疫组化染色评分
免疫组化评分由两名高年资病理医师显微镜下完成。每张切片于肿瘤细胞丰富区域随机取10个高倍镜视野，每视野计数100个细胞，分别按着色强度与着色百分比赋分并求其均值，即着色强度标准：无着色为0分，弱为1分，2分为中度，3分为强。阳性细胞所占百分比标准：阳性细胞数 < 5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。两者得分进行乘积：0和1分为“−”(阴性)；≥2分为“+”(阳性)。
2.5. 统计分析
所有统计分析均采用SPSS25.0软件进行，CD163与HER-2基因表达及其他临床病理特征比较采用χ2检验。术后生存率曲线利用Kaplan-Meier法和对数秩检验估计。对预后影响因素进行COX比例风险模型分析采用多因素分析。P < 0.05被认为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. CD163表达与HER-2及临床病理学关系
根据免疫组化评分规则将CD163的表达分为阴性和阳性，运用统计分析方法分析其与临床病理特征的关系。如表1所示，CD163阳性与肿瘤生物学行为，即TNM分期、淋巴结转移呈现明显相关，差别有统计学意义。CD163的表达与HER-2表达水平无显著性差异。
Table 1. The relationship between CD163 and clinicopathological characteristics
表1. CD163与临床病理特征的相关性分析
3.2. 生存分析
对60例胃癌患者进行随访，其中20例患者死亡。应用Kaplan-Meier法分析各临床特征与总生存的关系(表2)，胃腺癌手术患者总生存时间与淋巴结转移和TNM分期有关，与年龄、性别、HER-2基因表达、浸润程度、远处转移(腹水涂片阳性)、Laurens分型、分化程度、神经侵犯、脉管癌栓以及CD163的表达差异无统计学意义。
4. 讨论
在实体肿瘤微环境中，巨噬细胞是最丰富的免疫细胞。他们的存在被证实与多种癌症的预后较差相关。肿瘤微环境在维持肿瘤干细胞的未分化状态起着重要作用，并促进肿瘤的进展 [13]。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)重新编程的能抑制癌症的发展和转移，并可能成为一个有潜在前途的癌症治疗的新靶标 [14] [15]。TAMs沿淋巴管淋巴结转移 [16]。CD163是M2型肿瘤相关巨噬细胞的特异性受体，本课题旨在研究CD163表达情况与HER-2基因及其他临床病理特征的相关性以及CD163与胃腺癌患者术后总生存时间是否存在相关性。
Table 2. Correlation analysis of clinicopathological parameters and overall survival (OS) in patients with gastric cancer
表2. 临床病理参数与胃癌患者术后总生存(OS)相关性分析
相关研究表明，CD163巨噬细胞密度与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、浸润深度及TNM分期有关 [17]，然而在本研究中，CD163的表达仅与TNM分期及淋巴结转移相关，与HER-2基因状态无关。这与Lindsten，Hedbrant，Ramberg等人在乳腺癌患者中的研究结果一致 [12]。
CD163的表达与胃癌术后患者的预后是否相关仍存在争议。最近的一项Meta分析通过对11篇关于肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是否影响胃癌患者预后的论文进行荟萃分析，结果显示肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)不是影响胃癌患者术后总生存时间的独立危险因素 [18]。然而其他相关研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的大量浸润与预后不良密切相关，并在人胃癌上皮–间质转化现象中发挥重要作用 [19]，M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的浸润已被确定为一个独立的预后因素 [20] [21]。然而本研究结果显示CD163的表达与胃癌患者预后无关。
然而我们的研究尚存不足，第一巨噬细胞具有较高的可塑性，对不同的刺激，如细胞因子，容易改变其表型，应使用多种可靠的表面标志物进行评估 [22]；第二这是一个小样本的回顾性分析，仅就胃腺癌这一病理类型进行分析；第三没有研究肿瘤相关巨噬细胞是如何影响胃癌进展的分子机制。
5. 结论
综上所述，CD163的表达与HER-2基因表达无关，同时CD163的表达与胃腺癌术后患者的总生存时间无关，尚不能成为预测预后的指标。
同意书
该研究已获得病人的知情同意。
NOTES
*通讯作者。