1. 引言
骆驼蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科骆驼蓬属植物 [1] ，该属植物以生物碱类成分为主，以及含有多糖、黄酮、多酚等成分 [2] [3] [4] [5] 。药理活性广，具有祛风湿、消肿、止咳 [6] ，抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病、抗白血病等多方面药理作用 [7] [8] [9] [10] 。前人研究骆驼蓬总生物碱和多糖都具有一定的抗氧化活性 [11] [12] 。然而，对骆驼蓬不同极性溶剂提取物抗氧化活性测定未见报道。近年来，本课题组在开展骆驼蓬代谢组学研究过程中 [13] [14] ，以骆驼篷为原料，通过多种溶剂提取，优选出甲醇作为提取溶剂，并以清除DPPH自由基的抗氧化性活性为指标，采用单因素和均匀设计法进行提取工艺优化，目的是探索出一条有效的提取工艺路线，从而为后续代谢组学研究提供可靠的提取方法。
2. 材料和方法
2.1. 仪器和材料
KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SPECORD 200型紫外分光光谱仪(德国耶拿分析仪器股份公司)；BSA224S型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；2KD-4025型真空干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)。
DPPH，抗坏血酸，百灵威公司；骆驼蓬样本于2013年9月在新疆昌吉地区采集，经新疆师范大学生命科学学院李进教授鉴定为骆驼蓬Peganum harmala L.，经干燥后粉碎备用，凭证标本号：20130929，现存放于北京师范大学分析测试中心；水为超纯水；其余试剂为分析纯。
2.2. 试验方法
标准曲线的制作：准确称取DPPH 3.9 mg，用甲醇定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成质量浓度为7.8 × 10−2mg/mL的标准储备液，置冰箱中闭光保存备用(现用现配)。分别吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL的储备液用甲醇定容到4 mL，配置质量浓度分别为0，1.7，3.5，7.8，15.6，23.4，31.2，39.0，46.8 μg/mL标准使用液。用紫外–可见分光光度计测定上述标准溶液在516 nm波长处的吸光度，以DPPH浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，回归线性方程为：y = 0.0158x，R2= 0.9996，结果表明在DPPH浓度为1.7~46.8 μg/mL线性范围内浓度与吸光度呈良好的线性关系，充分说明该方法可准确测定抗氧化活性 [15] 。
供试品溶液的制备：骆驼蓬植物样本干燥、粉碎、过40目筛、精密称取骆驼蓬干粉2份，每份100 mg，置50 mL离心试管中，分别使用甲醇、正己烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇溶液作为提取溶剂，同一溶剂超声连续提取3次，每次20 min，3次过滤后的滤液合并，减压浓缩至干后得到浸膏样品，用甲醇配置成浓度为1 mg/mL的试液，使用1.2.3方法测定样品的清除DPPH自由基能力的抑制率IR值。
抗氧化活性的测定：测定方法同文献 [16] 并加以改进。在0.2 mL的DPPH (浓度：23.4 μg/mL，溶剂为甲醇)加入0.2 mL试液后摇匀，暗处静置30 min。无水甲醇作参比溶液，516 nm处测定其吸光度值Aj；同时测定0.2 mL的DPPH (浓度：23.4 μg/mL，溶剂为甲醇)加入0.2 mL无水甲醇混合液的吸光度值Ai；再测定0.2 mL试液与0.2 mL无水甲醇混合液的吸光度值Ac。通过公式(1)计算试液对DPPH的抑制率IR：
(1)
式中：Ac为未加测定液时DPPH的吸光度；
Aj为测定液在测定波长吸光度；
Ai为加测定液后DPPH的吸光度；
IR为DPPH的抑制率。
数据分析：标准曲线试验数据的统计分析结果采用Microsoft Excel软件；不同极性溶剂提取显著性差异分析采用邓肯式新复极差法进行方差分析，使用SPSS Statistics 20.0软件完成；骆驼蓬提取工艺采用均匀设计实验法，试验测定数据使用多元二次逐步回归分析方法，运用Matlab (2012b)软件完成。
3. 结果与分析
3.1. 清除DPPH自由基抗氧化性物质提取溶剂的选择
称取100 mg供试品骆驼蓬粉末各两份，分别加入甲醇、正己烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇溶液作为提取溶剂，每次5 mL，超声提取三次，每次超声功率500 W，温度控制在25℃，每次20 min，合并萃取液，浓缩后干燥，得到浸膏。用无水甲醇配置成浓度为1 mg/mL的试液，测定DPPH自由基清除能力，测定方法同2.2。对于不同极性的溶剂提取样本得到的DPPH抑制率(IR)数据进行方差分析(如表1所示)，采用邓肯式新复极差法。通过数据分析，可以看出，在95%置信区间内，p < 0.05的条件下不同提取溶剂提取所得的结果差异显著，其中所测得的抗氧化性(IR值)由高到低的顺序分别是：甲醇 > 正己烷 > 乙酸乙酯 > 丙酮 > 氯仿 > 正丁醇，甲醇、正己烷和乙酸乙酯、氯仿和丙酮、正丁醇之间提取效果差异均极显著。从单因素方差分析试验结果可以确定骆驼蓬的最优提取溶剂为甲醇。
Table 1. Result and variance analysis of DPPH antioxidants scavenging free radicals extracted by different extracting solvents
表1. 不同提取溶剂提取清除自由基DPPH抗氧化物质结果及方差分析
注：同列不同小写字母表示组间差异显著(α = 0.05)。
3.2. 骆驼蓬甲醇提取工艺的研究
称取0.1 g供试品骆驼蓬粉末各两份，分别加入甲醇溶液作为提取溶剂，采用均匀设计法的因素水平表的参数进行提取 [17] ，以DPPH自由基清除能力为评价指标，每个因素设置7个水平，按照均匀设计表U7(76)试验方案进行设计，均匀试验的因素水平表及结果见表2~表3。均匀实验三个因素取值x1是提取次数：1~3次；x2是提取时间：10~70 min；x3是加水量(液料比)：8~14倍，合并萃取液，浓缩后干燥，得到浸膏样品，精密称取质量。使用无水甲醇配置成浓度为1 mg/mL的试液，测定DPPH自由基清除能力，测定方法同2.2。采用均匀设计法来考察骆驼蓬的甲醇提取工艺，用Matlab软件模型回归分析 [18] 。
Table 2. Level table of conditional factors for extraction of antioxidants
表2. 抗氧化物质提取条件因素水平表
Table 3. Optimum extraction conditions of antioxidants using U7(76)
表3. 采用U7(76)抗氧化物质提取条件优化方案
依据均匀设计实验，使用Matlab (2012b)软件对实验测定结果进行统计分析，通过对数据进行多元二次逐步回归分析，得到回归方程(2)：
(2)
对回归方程采用逐步回归分析法进行优化，使用3种统计检验方法对模型进行检验。1、相关系数R，若相关系数|R|在0.8~1范围内，一般地可以判断回归变量之间的相关性比较强，从本实验所得到的R2= 0.9296，可知|R| = 0.9641，由此可以判定各回归变量之间具有较强的线性相关性；2、F检验法：如果当
时，拒绝原来假设的同时，完全可以认为因变量y与各个自变量x (自变量：
)之间存在显著地线性相关性，接受原来的假设，则认为因变量y与自变量x之间线性相关性不明显。本例数据显示
(查表)，由此可以得出因变量y与自变量x之间具有显著地线性相关性；3、p值检验法：假设当p < α (α为预定显著水平)，则说明因变量y与自变量x (自变量：
)之间存在显著地线性相关性。本例回归分析结果显示p = 0.0310 < α = 0.05，说明因变量y与自变量x之间具有显著地线性相关性。依据以上三种统计检验方法检验结果显示，说明因变量y与自变量x (自变量：
)之间存在显著线性相关性：因而模型(2)从整体来看可用性很大。方程中各项试验因子的回归系数和t检验结果如表4所示。由表4可知，提取次数(β0)，液料比(β1)对抗氧化物质的提取结果影响极显著，通过对方程模拟可以得到骆驼蓬中抗氧化物质提取的最优条件为：提取次数是3次，提取时间是20 min，料液比1:14 g/mL是最佳提取条件，其中提取次数是主要因素，液料比是次要因素，而超声时间是负相关(表4)。
Table 4. Calculation results of MATLAB program
表4. MATLAB程序的计算结果
利用数学模型模拟优化的实验条件(表5)和与均匀设计试验中测定结果最高的试验号(7号)进行对比验证试验，采用数理统计软件SPSS Statistics 20.0软件对所得到的实验结果进行单因素方差分析，实验方案如表6所示，在α < 0.01的水平，两种不同提取条件下，骆驼蓬甲醇提取物DPPH自由基清除能力具有极其显著的差异，结果表明，相同测定条件下，根据模型优化的实验条件更佳，说明对影响骆驼蓬抗氧化性物质提取工艺的3个因素水平进行均匀设计，得到最佳提取工艺条件完全是可靠的。
Table 5. Optimized results of extraction conditions
表5. 提取条件的优化结果
Table 6. Verification test scheme and results
表6. 验证试验方案及结果
注：同列不同大写字母表示组间差异极显著(α = 0.01)。
4. 结论
本文以DPPH自由基清除率为指标，通过使用不同极性溶剂提取骆驼蓬中的抗氧化性物质，从而筛选出甲醇作为提取溶剂；采用均匀设计实验方法优化骆驼蓬抗氧化性物质提取工艺。对试验所得结果采用多元线形回归计算方法和逐步回归分析，建立回归模型，通过对方程分析及预测，找到最优条件。试验得出骆驼蓬中抗氧化性物质的最佳提取工艺条件是：提取次数3次，提取时间20 min，料液比1:14 g/mL。利用最佳提取工艺，得到的骆驼蓬抗氧化抑制率为75.13%，说明此优化的提取工艺有效可行。抗氧化实验结果表明，骆驼蓬6个不同极性提取部分中均含有抗氧化活性物质，因溶剂极性不同，提取部位中化学成分有明显差异，所以其活性有所差异。整体而言，骆驼蓬甲醇提取物抗氧化性效果较好，DPPH清除自由基抑制率为74.64%，与其它溶剂提取物相比，抑制率明显增加，具有显著性差异。该工艺路线简单，成本低，有机溶剂使用量少，能够为本课题组后续代谢组学研究提供可靠的方法。
致谢
感谢北京师范大学资源学院杜树山老师。
基金项目
本项目得到以下基金项目的支持：新疆师范大学博士科研启动基金(No.XJNUBS1901)；新疆师范大学自治区教学改革与研究项目(No.ZJG2019-06)
参考文献