1. 引言
地衣是真菌(地衣中称为mycobiont，真菌生物体)与绿藻和/或蓝藻(地衣中称为photobiont，光合生物体)在漫长的进化过程中形成的稳定的共生联合体 [1] 。已发现的最早地衣化石在苏格兰4亿多年前泥盆纪的燧石中 [2] ，而在中国贵州瓮安发现的象地衣(lichen-like)的化石则更早，约为6亿年前 [3] 。在地衣中，除了占主体地位的共生真菌和光合作用的共生藻类，还存在许多内生的微生物，其中的真菌称之为地衣内生真菌(endolichenic fungi, ELF)。目前已发现的地衣近2万种，而据估计其内生真菌可超过10万种 [1] [4] 。大多数的ELF属于子囊菌门中的盘菌亚门(Pezizomycotina)，主要分布在粪壳菌纲(Sordariomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)和座囊菌纲(Dothideomycetes)中 [5] [6] 。
来源于真菌的抗生素和其他药物在世界各地已经使用了几十年，拯救了无数的生命。1928年发现的青霉素，是第一个源于真菌的抗菌化合物，其发现加速了真菌类微生物的药物开发 [7] 。近十年来，地衣内生真菌因其能产生独特的次级代谢产物受到越来越多的关注 [5] [6] [7] 。作为丰富天然产物宝库，地衣内生真菌和其宿主地衣一道已成为有机化学和生物医学领域共同关注的生物资源，目前从近30种地衣内生真菌已有超过145个新的代谢产物，包括甾体类、醌类、萜类化合物等被发现 [7] [8] [9] 。在地衣内生真菌作为潜在药物及重要生物活性物质资源被不断发掘的同时，其生防作用也逐渐被关注 [10] ，其中地卷属中的地衣内生真菌因其研究较为系统而得到特别重视 [11] [12] 。
本文对分离自湖北神农架地卷属地衣中的重要内生真菌菌株的生防活性进行初步研究；试验了3株地衣内生真菌对2种植物病害病原真菌及2种水霉病害病原卵菌的抑制作用，以期为植物病害及水霉病害防治提供新的途径，旨在为地衣内生真菌资源的开发及利用提供科学参考。
2. 材料与方法
2.1. 供试菌株
供试地卷属地衣内生真菌菌株Creosphaeria sassafras (GHL-LF2016R1)，Annulohypoxylon multiforme (GHL-LF2016R2)和Penicillium vulpinum (GHL-LF2016R3)，均分离自湖北神农架大龙潭地卷属地衣中，具体分离方法参照Li等 [9] 和范莉莉等 [10] 的文献。供试病原菌为引起植物病害的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerella cucumerina)；及引起水霉病的两性绵霉(Achlya bisexualis)和一种腐霉(Pythium capillosum)。上述菌株均由中国科学院微生物研究和河北师范大学的地衣研究组共同保存和提供。阳性对照生防菌球毛壳菌(Chaetomium globosum strain 6, CGS6)由河北师范大学地衣研究组提供。
2.2. 供试培养基
PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水定容至1000 mL。PDB培养基：PDA培养基中不添加琼脂。
2.3. 地衣内生真菌及病原真菌菌株的活化
将从湖北神农架林区采集的地卷属地衣中分离获得的3株地衣内生真菌及供试的4株病原菌及阳性对照球毛壳菌菌株CGS6接种于PDA斜面培养基上，25˚C培养，长满斜面后转接，经过3次转接活化。
2.4. 液体发酵培养及发酵液制备
在250 mL三角瓶中加入125 mL PDB培养基，封口膜封口，常规高压灭菌(121˚C 20 min)。静置冷却后，用解剖刀和接种针从活化的地衣内生真菌挑取0.5 cm × 0.5 cm的菌丝块5个接种于三角瓶的培养基中，25˚C下180~200 r/min的摇床上振荡培养15 d。每种地衣内生真菌接种4瓶。发酵培养终止，离心，用四层无菌纱布过滤发酵产物，同种的滤液合并浓缩至100 mL，置于4˚C冰箱中保存备用。
2.5. 地衣内生真菌发酵液抑制病原真菌的活性测定
取制备好的地衣内生真菌发酵浓缩液2 mL，加入18 mL预融化的PDA培养基中，混匀，制成含发酵液的培养基。待培养基在9 cm的平板中凝固后，在中央接入供试病原真菌的菌块(0.5 cm × 0.5 cm)，使带有菌丝的一面贴在培养基表面，每个处理设3次重复。以未添加地衣内生真菌发酵浓缩液的培养基接种病原真菌为对照，25˚C培养7 d。
通过十字交叉法测量供试病原真菌的菌落直径，按公式：抑制率(%) = (对照病原真菌菌落直径 − 处理的病原真菌菌落直径)/对照病原真菌菌落直径× 100%计算地衣内生真菌发酵液对病原真菌的抑制率。
2.6. 菌株对峙培养及竞争作用的测定
将3株地衣内生真菌分别和2株可引起植物病害的供试病原真菌进行对峙培养，先将地衣内生真菌和植物病原真菌分别在直径9 cm的PDA培养基上培养5 d，用直径0.5 cm的打孔器取其菌饼置于平板两侧，两菌饼相距5 cm，25˚C恒温箱静置培养。观察并记录对峙生长情况，以单独接病原真菌为阴性对照，生防菌球毛壳菌菌株CGS6为阳性对照，设置5个重复。培养5 d后，测量病原真菌菌落直径，观察地衣内生真菌对植物病原真菌菌落的抑制情况，并按2.5节中所列公式计算抑菌率。
2.7. 数据统计与分析
试验数据采用Excel列表，通过SPSS 19.0软件进行作图和采用单因素方差分析检验(ANOVA-LSD法)地衣内生真菌菌株抗病原菌活性之间的差异显著性水平(P < 0.005)。
3. 结果与分析
3.1. 三
株地卷属地衣内生真菌的培养特征和系统位置
供试3株地衣内生真菌均分离自湖北神农架大龙潭的地卷属地衣(表1)，其培养特征描述如下。各菌株与相近类群基于真菌首选DNA条形码ITS序列的系统发育树见图1。各菌株的形态及培养特征与分子鉴定结果一致。
Creosphaeria sassafras (Schwein.) Y. M. Ju, F. San Martín & J. D. Rogers, Mycotaxon 47: 223 (1993)
菌株GHL-LF2016R1在9 cm平板PDA培养基上，25˚C培养7 d直径可达7.5 cm，菌落初期白色，后期铁灰色、棕褐色至褐色，菌落平展，弥散，边缘不规则。菌丝埋生或表生，分枝，具隔，淡褐色；分生孢子梗具分枝，有隔。分生孢子长椭圆形或近纺锤形，单胞，无隔；7.0~10.0 × 3.5~7.5 μm。
Annulohypoxylon multiforme (Fr.) Y. M. Ju, J. D. Rogers & H. M. Hsieh, Mycologia 97(4): 859 (2005)
菌株GHL-LF2016R2在9 cm平板PDA培养基上，25˚C培养7 d直径可达5.5 cm，菌落初期白色，后棕褐色至黄褐色，羊毛状，无环纹，不成带，边缘弥散不规则，零散分布黑色小块；平板背面暗绿色。产孢结构粗糙，黄色至浅棕色；产孢细胞透明，光滑，10.0~20.0 × 2.5~3.0 μm；分生孢子透明，椭球形，3.5~6.5 × 2.5~3.0 μm。
Penicillium vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson, in Samson & Pitt (eds), Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics (
New York
): 144 (1986) [1985]
菌株GHL-LF2016R3在9 cm平板PDA培养基上，25˚C培养9 d直径可达4.5 cm，表面菌丝体白色，形成菌丝束，菌丝束基部深棕色，排列成环形带，具透明渗出液，培养基背面黄棕色；有特殊气味；产生不规则帚状枝，每轮2~4个梗基，棒状，9.0~12.0 × 2.0~3.0 μm，瓶梗细长，圆柱状，每轮3~5个，9.0~12.5 × 2.0~2.5 μm；分生孢子椭圆形或近球形，浅蓝绿色至蓝绿色，胞壁光滑，3.5~4.5 × 3.0~3.5 μm。
Table 1. Systematic positions of 3 endolichenic fungi isolated from Peltigera
表1. 三株地卷属地衣内生真菌的系统位置
Figure 1. The phylogenic tree of the endolichenic fungal strains based on ITS sequence
图1. 基于ITS序列的地衣内生真菌的系统发育树
3.2. 地衣内生真菌发酵液对病原真菌的抑制效果
Annulohypoxylon multiforme的发酵液对水霉病病原卵菌两性绵霉的抑制作用较强，平均抑制率超过70%；Creosphaeria sassafras的发酵液对黄瓜萎蔫病菌(78.3%)和两性绵霉(50.4%)的抑制作用较为明显； Penicillum vulpinum的发酵液对4种供试病原菌均具有较强的抑制活性，尤其对两性绵霉达到81.3%。在对植物病原菌黄瓜萎蔫病菌和腐皮镰刀菌的抑制作用中，均有2株地衣内生真菌优于对照的球毛壳菌，而在对引起水霉病的两性绵霉的抑制作用中，3株地衣内生真菌均优于对照的球毛壳菌；但是所有菌株对腐霉的抑制作用均不明显(图2)。
3.3. 地衣内生真菌与植物病原真菌的营养竞争关系
根据3株地衣内生真菌和2株植物病原真菌对峙培养后第5 d测定的抑制率可以看出(表2)，Creosphaeria sassafras和Penicillium vulpinum分别对黄瓜萎蔫病菌、腐皮镰刀菌有较好的抑制作用，其抑制率菌均超过60%，表现出较好的竞争优势；而Annulohypoxylon multiforme及Penicillium vulpinum分别对黄瓜萎蔫病菌、腐皮镰刀菌的抑制作用也优于对照生防菌球毛壳菌。这些地衣内生真菌在与植物病原真菌的营养竞争过程中占有一定优势，其抑制作用与发酵培养液的效果一致。
Figure 2. The inhibition rate of the endolichenic fungi against pathogens
图2. 地衣内生真菌对病原菌的抑制率
Table 2. The inhibition rate (%) of 3 endolichenic fungi from Peltigera against 2 pathogens
表2. 对峙培养中3株地卷地衣内生真菌对2种植物病原真菌的抑制率(%)
Note: Data were the mean ± SD. The lowercase letters in the same column indicated significant difference at 0.005 level. The control strain Chaetomium globosum marked with*。注：表中各数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写英文字母表示在0.005水平上差异显著。标有*号的菌株为对照球毛壳菌。
4. 讨论
目前，农业生产和水产养殖上通常超量使用化学药剂防治病害，其效果明显，但后果也很严重，产生了一系列问题，如污染环境、农药残留和产生抗药性等。生物防治是用合适的微生物代替化学药剂通过生物之间的相互作用来抑制病原菌的生长及繁殖，从而达到有效控制的效果。这种方法绿色环保、人畜无害、循环性强，可以减少化学防治带来的污染问题，符合当前我国农业和环境可持续发展的迫切需求 [13] 。
在神农架地卷属地衣中分离的850余株内生真菌中，挑选30株对引起植物病害和水霉病害的病原菌进行生防活性研究，初选出12株内生真菌至少对1种病原菌表现出一定水平的抑制作用(抑制率 > 30%)。本文报道其中3株抑制作用较强的，至少对其中1种病原菌的抑制率大于50%。范莉莉等 [10] 报道从扁枝衣(Evernia mesomorpha)中分离的地衣内生真菌FF-6菌株(与Xylaria frustulosa相近)，对黄瓜萎蔫病菌有较好的抑制作用，我们从地卷中分离的内生真菌对植物病原菌的抑制作用，1株与其相当，2株较其更优。在研究中，对于数据的统计分析，我们将统计显著性的默认P值阈限设置为0.005。我们认同对于新现象的探索研究中，如果P值在0.005到0.05之间，则应该使用“启示性(suggestive)”来标示；如果P值小于0.005，才能使用统计显著 [14] ，以避免出现假阳性，进而得出误导性结论。
内生真菌是一个多样性丰富的生物类群，在生物防治方面有着重要的开发利用价值。其中毛壳菌属的种类，特别是球毛壳菌对多种植物病原菌有很好的抑制作用 [15] [16] [17] [18] [19] 。我们获得的地衣内生真菌较一般的毛壳菌对植物病原菌的抑制作用更强，但与优良菌株的比较尚待进一步试验。对于水产养殖中水霉病的防治，自从孔雀石绿被禁用以来，试验了多种试剂及其组合，尚无特别有效的方法 [20] [21] 。地衣中的松萝酸及一些地衣提取物被用来抑制水霉病相关病原卵菌的研究 [20] [21] ，有一定的作用，但效果不显著，生产上可行性小。使用地衣内生真菌发酵液效果较好，有望开拓控制水霉病防治的新途径。
近来，有研究显示，生防菌剂的复配效果比单一生防菌剂的生防效果要好，生防菌可以不同种类间复配，也可以与次生代谢产物复配，提高生防的效果和稳定性 [13] 。因此，对来自地衣内生真菌的生防菌株菌剂复配的研究将有可能成为今后探索其生防活性的一个新方向。
致谢
感谢湖北省神农架国家级自然保护区管理局科研所相关人员在野外采样时提供帮助。
基金项目
国家科技支撑计划项目(2013BAD03B03)和湖北省重点实验室开放基金(2012snjAB001)资助。