1. 引言
饮料是目前市场上非常畅销的产品，为了满足人们需要，各种各样口味的饮料随之出现。目前饮料一般是采用巴氏杀菌工艺，有的同时采用紫外线灭菌，但是，有些饮料仍会有微生物污染；因此，寻找快速、准确鉴别污染饮料微生物的方法对于饮料生产厂家有效解决该问题具有重要的意义。传统的真菌分类学主要按照真菌的形态学、生理生化特点、抗原构造等特征；由于真菌的种类众多、个体多态性明显，因此传统的分类学指标常会得出假阳性或假阴性结果，给真菌的分类鉴定带来了一定的难度；近些年来，利用真菌的基因型，特别是核糖体DNA(rDNA) (18S、28S或5.8S)基因及内转录区间隔序列(ITS, intervening internal transcribed spacer)的序列比对和分析的方法进行微生物分类鉴定已开始凸显出自身的优势；该法简便易行，事先无需对微生物特性有所了解，快速而可靠，特别是在表性特性鉴定失败时(如突变菌株的鉴定)有优势，所以在医学、食品等微生物鉴定上也崭露头角，正成为微生物分类鉴定的重要方法之一[1] -[3] 。陈剑山等提出利用PCR扩增病原菌核糖体ITS (Internal Transcribed Spacer)基因区段进行真菌鉴定、检测及病害诊断的方法因其快速、准确、简便而得到迅速地发展 [4] 。总结以上方法优缺点，该实验将传统的微生物鉴定方法结合现代分子生物学研究技术对未知微生物的形态、基因等进行鉴定，以确保准确鉴定出污染该饮料的微生物；以下为我们对该未知微生物进行鉴定的一系列的方法及结论。某饮料厂的功能饮料在2012年1月到6月期间持续遭未知微生物污染，采取多种防控措施无效，故委托本实验室对该未知微生物污染事件进行鉴定，以解决饮料污染问题；同时也为饮料行业中饮料污染问题的解决提供了一系列的理论依据和方法。
2. 材料与方法
2.1. 样品
用已污染的瓶装饮料B1-B5、未污染的饮料G1-G5接种到培养基中进行培养；随机取B2和B5接种的培养基中生长成熟的微生物，对其进行分子生物学技术的实验诊断。
2.2. 培养基
沙氏培养基、营养肉汤培养基、普通琼脂培养基。其中沙氏培养基主要用于真菌培养，普通琼脂培养基、营养肉汤培养基主要用于细菌培养。
2.3. 试剂
DNA提取试剂盒为BioFluX公司的Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit (cat.No:BSC14S1)；引物为通用引物ITS1、ITS4，由宝生物公司合成；PCR反应液为宝生物公司的PerfectShotTMTaq，内含loading dye mix，(code:D308A)；DNA纯化试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification (code:DV807A, lot:CA2001.)；溴化乙锭(北京鼎国)，BIOWST AGAROSE (上海GENETECH)，1X TAE电泳缓冲液，液氮，棉兰染色液。
2.4. 仪器设备
盖玻片，载玻片，接种环，研钵，酒精灯，1.5 ml、0.5 ml离心管，1000、200、10 μl移液枪(GILSON)及枪头，高速离心机(美国Sigama)，PCR仪(杭州博日)，电热恒温水浴箱(上海医疗器械)，压力蒸气灭菌器(上海博迅)，电泳仪(BAYGENE BG-Power 600i)，T6紫外可见分光光度计(北京普析通用)，生物安全柜(Thermo)。
2.5. 实验方法
2.5.1. 培养方法
取污染饮料和未污染的饮料分别接种到沙氏肉汤琼脂、营养肉汤琼脂、沙氏肉汤和营养肉汤培养基中，其中一组四种培养基放在阴暗、潮湿处2周后观察结果，另一组四种培养基放在37℃温箱中，培养24~48小时后观察结果。
2.5.2. 棉兰染色法
用接种环从菌落的边缘挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层；然后在载玻片的中央有菌部分滴加乳酸石炭酸棉兰染色液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免气泡产生。显微镜下镜检，先低倍镜后高倍镜。
2.5.3. 基因组DNA提取及ITS区PCR扩增与序列测定
引物：为通用引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) [5] [6] ，由宝生物公司合成。
DNA模板制备：取培养基中对数期菌落放入研钵，将其用液氮进行研磨均匀后，按照试剂盒上步骤说明进行DNA的提取；琼脂糖凝胶电泳检测DNA产物，用分光光度计对DNA进行定量。
PCR体系和条件：PCR反应液25 μL，ITS1 1 μL (浓度为20 μM)，ITS4 1 μL (浓度为20 μM)，DNA模板0.5 μL，蒸馏水22.5 μL，总反应体系为50 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环扩增36次；72℃ 7 min终延伸，4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。PCR产物的纯化：TaKaRa纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，操作步骤按说明书进行；琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物。
PCR产物测序：由昆明滇工科技有限公司代理上海生工对纯化后的PCR目的片段进行测序。
2.5.4. 序列比对和系统发育树的构建
将ITS区序列在GeneBank核酸序列数据库(即在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行BLASTN比对)中进行比对，获取相关序列，并与测定序列一起用Clustal W(1.83)软件进行序列比对。以MEGA5.1的p-distance模型计算进化距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，并计算bootstrap值。
3. 结果
3.1. 培养结果
用未污染的饮料接种的培养基中，均无微生物生长；用污染的饮料接种的培养基中，37℃温箱中，各培养基均无微生物生长，从而排除是细菌污染；阴暗/潮湿环境中，均有微生物生长，其中比较典型的菌落如下。
3.1.1. 肉眼观察菌落
从左到右依次是沙氏、营养琼脂培养基未知菌生长情况。根据菌落及生长环境初步鉴定为真菌污染。
该菌菌落生长较快。菌落正面色泽也随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状；孢子成熟后颜色变为褐色；表面平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色，见图1。
3.1.2. 镜下观察真菌
取少量真菌用棉兰染色法将其染色后，镜下观察在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状；制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙，顶囊呈烧瓶形或近球形；分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙；见图2；进一步显示该未知微生物属于真菌，但具体是真菌中哪一类，还需进一部鉴定。
3.2. 总DNA提取
用DNA提取试剂盒，严格按照其说明书步骤，提取的该真菌的DNA，经分光光度计检测其浓度为B2为19 ng/μL，B5为11 ng/μL，琼脂糖凝胶电泳并经紫外光检测其分子量大小如图3。
1A，沙氏培养基；1B，营养肉汤培养基；1C普通琼脂培养基
Figure 1. Bacterial colony characteristics of the unknown microbe colonies
图1. 未知菌菌落特点
Figure 2. Morphological characteristics of the unknown microbe
图2. 未知菌的形态学特点
M1: 250 bp DNA Marker; 1: B2 DNA; 2: B5DNA; 3: B2 ITS PCR amplification; 4: B5 ITS PCR amplification; 5: B2 ITS purification; 6: B5 ITS purification; M2: 100 bp DNA Marker
Figure 3. AGE analysis of the unknown microbe’s DNA, ITS PCR amplification, ITS purification
图3. 未知菌DNA、ITS区PCR扩增产物、纯化后ITS区基因片断琼脂糖凝胶电泳分析
3.3. PCR产物
用总DNA作为模板，ITS1、ITS2为引物，进行PCR反应，扩增出目的条带(包括ITS1、5.8S和ITS2的全长ITS区域序列)，大小约600 bp，经琼脂糖凝胶电泳及紫外光检测结果如图3。
3.4. PCR纯化结果
用PCR纯化试剂盒对PCR扩增后产物进行纯化，以备测序时用；纯化结果经琼脂糖凝胶电泳及紫外光检测，结果如图3。
3.5. 测序结果
对纯化后的目的条带由测序公司进行测序，B2菌序列结果如图4；B5菌序列结果如图5。
3.6. 序列比对结果及进化树的构建结果
3.6.1. 采用Blastn工具进行的序列比对结果
B2菌比对结果如表1，B5菌比对结果如表2。比对结果显示，B2与B5未知菌与黄曲霉菌同源性高达94%~95%。
3.6.2. 进化树构建结果
将比对相关序列与测定序列进行进化分析，结果如图6；结果显示，B2、B5未知菌与黄曲霉菌同在一个分支上。根据同源性比较和系统发育分析，可以看出，污染该饮料的未知菌是黄曲霉菌。
Figure 4. Sequence of B2 microbe’s ITS PCR amplification
图4. B2菌ITS区PCR扩增产物测序序列结果
Figure 5. Sequence of B5 microbe’s ITS PCR amplification
图5. B5菌ITS区PCR扩增产物测序序列结果
Table 1. BLASTn comparison of B2 microbe
表1. B2菌BLASTn比对结果
Table 2. BLASTn comparison of B5 microbe
表2. B5菌BLASTn比对结果
Figure 6. Phylogenetic tree base on ITS sequence of unknown microbe and Aspergillus flavus
图6. 未知菌与相关黄曲霉菌ITS区序列的系统发育分析
4. 讨论
我们通过培养特性、形态学和分子系统学鉴定表明，此次饮料污染属于黄曲霉菌污染。分子系统学是鉴定食品饮料微生物污染的有效手段。林晓民等描述核糖体基因中内转录间隔区包含2个不同的非编码区域，即内转录间隔区1 (ITS1)和内转录间隔区2 (ITS2) [7] 。ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8 S RNA基因也被包括在ITS之内。ITS序列在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值。
郑雪松等总结真菌核糖体基因(rDNA)由小的亚单元(18 S)、ITS1区、5.8 S区、ITS2区和大的亚单元(28 S)构成，rDNA上的5.8、18和28S rRNA基因有极大的保守性，即存在着广泛的异种同源性 [8] 。而由于ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征。ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析；由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小、易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中；根据这些基因上高度保守区段设计出通用引物，借助PCR技术扩增rDNA的目的片段进行序列分析。
郝天婷，周帼萍在已知真菌污染果汁饮料的情况下，利用26S rDNA基因序列分析鉴定出橙汁和葡萄汁中的污染菌为费希新萨托菌和出芽短梗霉菌 [9] ，由于其是果汁中常见耐热污染菌之一，故没有对其进行进化树构建以对比其系统发育；李辉等利用形态学方法和ITS区序列分析法分离并鉴定出2株霉菌，进化树构建结果显示该2株霉菌分别为黄暗青霉和光孢青霉 [10] ；该2例研究均是对特定饮料中已知真菌进行的分离及鉴定研究，且该真菌为饮料中常见污染菌，具有一定的参考价值。郭伟鹏等在果汁饮料中耐热霉菌的分离和鉴定研究中，运用传统微生物检测方法对污染饮料中微生物进行了分离、纯化、鉴定及耐热霉菌检测，结果鉴定出3种耐热霉菌，该实验主要是对耐热霉菌的检测 [11] 。由此可见，饮料中的微生物污染，尤其是真菌，极为常见；寻找适用于各种微生物检测的系统、快速、准确的检测方法尤其必要。
黄曲霉是温暖地区常见的占优势的霉菌，其生长温度范围在4℃~50℃之间，最适生长温度为25℃~40℃。黄曲霉毒素形成的最低温度为5℃~12℃，最高为45℃，最适温度为20℃~30℃ (28℃)。黄曲霉菌主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染；其中以花生和玉米污染最严重。黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素具有很强的毒性，特别是它的强致癌性，世界各国对于其污染食品的情况都很重视；因此，如果饮料的原材料中涉及易被黄曲霉污染的材料时应引起人们的高度关注，严格杜绝黄曲霉污染，以防该毒素对人们的健康产生更大的危害。
5. 结论
我们利用真菌的通用引物ITS1和ITS4扩增了污染该饮料真菌的部分ITS序列，长度为600 bp左右，包括18S DNA部分序列，ITS1-5.8S-ITS2全序列和28S DNA部分序列；利用这个片段开展的BLASTN比对，发现其对应NCBI上大量曲霉属(Aspergillus flavus)真菌的相应序列，长度约400 bp左右；将这些相关序列与我们所测定的序列构建进化树发现，它们同属曲霉菌属。结合前面的形态学观察结果，我们推断，实验中所测的真菌为黄曲霉菌。
*通讯作者。