1. 引言
蚯蚓隶属于环节动物门(Annelida)寡毛纲(Oligochaeta)，是重要的土壤动物类群，通过新陈代谢活动促进凋落物中的营养元素，尤其是氮、磷循环和周转速率，提高土壤质量，对土壤腐殖化、碳氮分解及土壤固碳具有重要作用[1]-[3]。同时，蚯蚓可用于土壤污染治理，其不仅能以表皮接触扩散和摄食作用的方式直接去除部分有机化合物，还可以通过改良土壤环境、刺激土壤酶活性等方式促进污染物降解[4] [5]。我国已记载的远盲蚓属蚯蚓物种数量众多，是世界上远盲蚓属蚯蚓分布最多的国家[6]。
龙溪–虹口国家级自然保护区位于都江堰市北部，龙门山褶皱带中南部，属于青藏高原向四川盆地的过渡区域，气候类型为中亚热带湿润季风气候，典型的高山峡谷地貌，地理坐标为31˚04'~31˚22'N，103˚32'~103˚43'E，保护区海拔1196~4582 m，多年平均降水量1500 mm，多年平均气温15.2℃，总面积310 km2。栗子坪国家级自然保护区位于雅安市石棉县境内，在横断山区东缘、四川盆地西南缘的大渡河中上游，气候类型为中亚热带季风常绿阔叶林气候，地理坐标为28˚51'~29˚08'N，102˚10'~102˚29'E，保护区海拔1688~3214 m，多年平均降雨量为813 mm，多年平均气温17℃，总面积480 km2。两个国家级保护区内动植物资源极其丰富，是全球生物多样性热点区域之一[7]。目前，国内针对这两个保护区的研究，主要集中在景观多样性和植被自然演替等方面[8] [9]，关于土壤动物物种多样性的研究还较为缺乏。因此，本文旨在为土壤动物蚯蚓多样性的编目、保护和管理提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
使用挖掘法在龙溪–虹口国家级自然保护区和栗子坪国家级自然保护区采集蚯蚓样本。野外采集到的活体样本需要在采集当天处理，步骤如下：清水洗净——10%浓度乙醇浸泡麻醉——无水乙醇定型(用竹镊子辅助固定)——50 ml收纳管中储存(无水乙醇没过蚯蚓)——每天更换无水乙醇至无液体稀出。
2.2. 形态鉴定
标本完全固定后，使用解剖镜对蚯蚓形态特征进行描述，根据1986年陈义的中国蚯蚓、1972年Sims和Easton等对远盲蚓属蚯蚓特征表述[10] [11]，仔细观测并记录新物种的外部形态特征，包含体长、环带宽、受精囊孔位置及对数、雄孔区特征等，解剖后进行标本固定并详细测量记录内部特征，包含受精囊位置及对数、盲肠位置及大小、前列腺形态特征等。拍摄细节照片，使用Adobe illustrator CC绘制相关特征矢量图。将物种与中国及周边国家远盲蚓属蚯蚓的物种特征进行比对，确认物种特异性[12] [13]。
2.3. DNA提取及测序
取5 g蚯蚓尾部组织，洗净剪碎，使用无脊椎动物DNA试剂盒(OMEGA)提取DNA。使用引物HCO2198和LCO1490扩增线粒体COI基因[14]。PCR扩增温度、时间、循环条件等见参考文献董彦[15]，PCR产物送至华大基因上海分公司进行切胶、提取、纯化、测序。使用seqverter及MeGa等软件对测序结果进行处理，COI基因序列在线提交GenBank并进行比对，确保物种为未发表物种。
3. 结果与讨论
3.1. 龙门远盲蚓(Amynthas longmenmontis Dong & Jiang, sp. nov.)
正模：SC201730-03，1条成体，2017年05月14日采于四川省龙溪–虹口国家级自然保护区，表土层，黄褐壤，采样点地理坐标31˚10'41''N，103˚39'32''E，海拔1272 m。标本采集人：袁柱、蒋际宝、董彦、赵琦、高杏、陶治旻。
词源学：依据采集地点“龙门山”命名。
DNA条形码：GenBank登录号MH843418 (SC201730-03，正模)。
Figure 1. Amynthas longmenmontis Dong & Jiang, sp. nov., holotype. a. ventral view; mp. male pores; b. ventral view, sp.p. spermathecal pores; c. prostates gland; d. spermathecae
图1. 龙门远盲蚓，正模。a. 腹面, mp.雄孔；b. 腹面, sp.p受精囊孔；c. 前列腺；d. 受精囊
外部特征(表1)：成体体长76 mm，环带宽3.8 mm，体节数70节。周身为浅土黄褐色，环带浅褐色，无体环，背中线清晰。刚毛环生，环带前稀疏且较粗，刚毛式：AA = 1.2 − 1.4 AB，ZZ = 1.6 − 1.8 ZY (环带前)，ZZ = 2.0 − 2.2 ZY (环带后)。雄孔1对，位于XVIII节腹侧两边，雄孔间距约1/3节周长，位于1个中等偏小的圆形平顶突起上，有一圈皮褶包围(图1(a))。受精囊孔4对，位于5/6~8/9节间，小眼状，孔区清晰，孔间距1/3节周长，紧贴8/9节间沟后方，第IX节刚毛环前有1对间距为1/4节周长的圆形小乳突(图1(b)) [16]。
内部特征(表1)：砂囊长桶状，前细后粗，位于IX~X节。小肠自XV节开始膨大。盲肠单式，起于XXVII节，位于XXVII~XXIV，指状，背腹缘均较光滑。心脏4对，较发达。精巢囊2对，发达。储精囊2对，发达。前列腺退化，前列腺管呈“6”字形(图1(c))。受精囊4对，位于VI~IX节(图1(d)) [16]。
评论：龙门远盲蚓腹侧5/6~8/9节间具有4对受精囊孔，属于A. corticis物种群。
龙门远盲蚓与分布于四川峨眉山的小囊远盲蚓[Amynthas exilens (Zhong & Ma, 1979)]体型大小相似，雄孔在XVIII节，盲肠单式，受精囊孔4对，位于5/6~8/9节间，前列腺退化，受精囊呈退化状[17]。但龙门远盲蚓与小囊远盲蚓存在以下差异：新种背孔起于11/12节间，小囊远盲蚓背孔起于12/13节间；新物种环带上无刚毛，小囊远盲蚓环带腹面XVI节有刚毛；新物种刚毛稀疏，小囊远盲蚓刚毛稠密；新物种雄孔间距约1/3节周长，小囊远盲蚓雄孔间距约2/5节周长；新物种雄孔区无乳突，小囊远盲蚓雄孔区有3对乳突；新物种受精囊孔孔区清晰，在紧贴8/9节间沟后方有一对圆形小乳突，小囊远盲蚓受精囊孔小且有时肉眼不可见，在第VIII节刚毛环后有一对乳突，有时缺一或全缺。
龙门远盲蚓与Amynthas dispersus Sun & Qiu, 2018体型大小相似，背孔均起于11/12，环带腹侧均没有刚毛，受精囊孔4对，位于5/6~8/9节间，孔间距1/3节周长，第IX节有1对生殖乳突，盲肠单式，前列腺呈现相似的退化状态[18]。但龙门远盲蚓与A. dispersus有以下差异：新物种环带以后刚毛更密，A. dispersus环带以后刚毛稀疏；新物种雄孔较小，孔区无乳突，A.dispersus雄孔较大，在XVII~XX有1~3个可变乳突；新物种受精囊无盲管，A. dispersus受精囊有盲管，且和主体长度相当。
3.2. 暗色远盲蚓(Amynthas impolitus Dong & Qiu, sp. nov.)
正模：SC201749-04，1条标本，成体，2017年05月21日采集于四川省栗子坪过家家自然保护区，表土层，褐壤，采样点地理坐标为28˚53'20''N，102˚21'18''E，海拔2607 m。标本采集人：袁柱、蒋际宝、董彦、赵琦、高杏、陶治旻。
词源学：依据蚯蚓体色特征的描述命名。
DNA条形码：GenBank 登录号MH843439 (SC201749-04，正模)。
外部特征(表1)：成体体长44 mm，环带宽2.8 mm，体节数102节。体中部背侧黄褐色，其余部分为土黄色，无体环，背中线清晰。刚毛环生，刚毛式：AA = 2.0 − 3.0 AB，ZZ = 1.4 − 2.0 ZY。雄孔1对，位于XVIII节腹侧两边，孔间距略大于1/4节周长，各位于1个椭圆形小突起上(图2(a))。受精囊孔4对，位于5/6~8/9，小眼状，孔区清晰，孔间距略大于1/4节周长(图2(b)) [16]。
内部特征(表1)：砂囊长桶状，前细后粗，位于IX~X节。小肠自XV节开始膨大。盲肠起于XXVII节，位于XXIII~XXVII，过渡态，背缘较光滑，腹缘有6个指状小囊(图2(c))。心脏4对，较发达。精巢囊2对，较发达。储精囊2对，较小。前列腺发达，前列腺管呈倒“U”形。受精囊4对，位于VI~IX节(图2(d)) [16]。
评论：暗色远盲蚓属于A. corticis物种群，与分布于台湾地区的Amynthas penpuensis Shen, Tsai &Tsai，2003相似，环带上无刚毛，环带前后均没有乳突，刚毛数量相似，背孔起于5/6~6/7节间，环带上有背孔痕迹，雄孔间距均约为1/4节周长，受精囊孔4对，位于5/6~8/9，受精囊盲管比主体短[19]。但暗色远盲蚓与A. penpuensis有以下区别：新物种体型较小，A. penpuensis体型较大；新物种雄孔较小，位于一椭圆形小突起上，A. penpuensis雄孔较大，周围有2~4条褶皱；新物种受精囊孔小眼状，孔区清晰，A. penpuensis受精囊孔不明显；新物种盲肠指状，过渡态，A. penpuensis盲肠单式；新物种盲管前端1/4膨大为纳精囊，A. penpuensis盲管前端1/2膨大为纳精囊。
暗色远盲蚓与分布于云南的元江远盲蚓[Amynthas yuanjianggensis Sun & Qiu, 2021]相似，环带腹侧均没有刚毛，刚毛数量前少后多，盲肠为过渡态，受精囊孔4对，孔区清晰，在5/6~8/9节间，盲管前端膨大为纳精囊[20]。但暗色远盲蚓与元江远盲蚓有以下区别：新物种体型较小，元江远盲蚓体型较大；新物种环带土黄色，环带上有背孔痕迹，元江远盲蚓背部黄褐色，环带灰棕色，背孔缺失；新物种雄孔无皮褶包围，元江远盲蚓雄孔有3层皮皱包围；新物种前列腺发达，元江远盲蚓前列腺退化，其左腺腺退化为小而紧凑的分叶，右侧前列腺发达；新物种盲管前端膨大为长卵圆形纳精囊，元江远盲蚓前端膨大为杆状纳精囊。
Figure 2. Amynthas impolitus Dong & Qiu, sp. nov., holotype. a. ventral view, mp. male pores; b. ventral view, sp.p. spermathecal pores; c. intestinal caeca; d. spermathecae
图2. 暗色远盲蚓，正模。a. 腹面, mp.雄孔；b. 腹面, sp.p受精囊孔；c. 盲肠；d. 受精囊
3.3. 黄褐远盲蚓(Amynthas fulvidus Dong & Sun, sp. nov.)
正模：SC201750-01，1条标本，成体，于2017年05月21日采集于四川栗子坪国家级自然保护区，表土层，褐壤，采样点地理坐标28˚53'24''N，102˚21'29''E，海拔2678 m。标本采集人：袁柱、蒋际宝、董彦、赵琦、高杏、陶治旻。
词源学：依据蚯蚓体色特征的描述命名。
DNA条形码：GenBank登录号MH843467 (SC201750-01，正模)。
外部特征(表1)：成体体长47 mm，环带宽3.6 mm，体节数66节。黄褐色，环带灰褐色，无体环，背中线模糊可见。刚毛环生，刚毛式：AA = 1.4 − 1.8 AB (环带前)，AA = 2.0 − 2.6 AB (环带后)，ZZ = 1.6 − 1.8 ZY。雄孔1对，位于XVIII节腹侧两边，两孔腹侧间距略大于1/4节周长，各位于一个中等大小的圆形突起上；圆形突起周边形成白色椭圆形腺区(图3(a))。受精囊孔4对，位于5/6-8/9节间，小眼状，孔区清晰，孔间距略大于1/4节周长(图3(b)) [16]。
Figure 3. Amynthas fulvidus Dong & Sun, sp. nov., holotype. a. ventral view; mp. male pores; b. ventral view, sp.p. spermathecal pores; c. intestinal caeca; d. spermathecae
图3. 黄褐远盲蚓，正模。a. 腹面, mp.雄孔；b. 腹面, sp.p受精囊孔；c. 盲肠；d. 受精囊
内部特征(表1)：砂囊长桶状，位于IX~X节。小肠自XV节开始膨大。盲肠起于XXVII节，位于XXIII~XXVII，指状，单式，背腹缘均较光滑(图3(c))。心脏4对，较发达。精巢囊2对，发达。储精囊2对，发达。前列腺非常发达，前列腺管呈倒“U”形。受精囊4对，位于VI~IX节(图3(d)) [16]。
评论：新物种属于A. corticis物种群，褐色远盲蚓与广布物种的皮质远盲蚓[Amynthas cortices (Kinberg, 1867)]相似，环带上无刚毛，受精囊孔4对，位于5/6-8/9，盲肠单式[21]。但褐色远盲蚓与皮质远盲蚓有以下区别：新物种体型较小，皮质远盲蚓体型较大；新物种体色黄褐色，环带灰褐色，皮质远盲蚓背面深棕色；新物种雄孔区、受精囊孔区没无乳突，皮质远盲蚓雄孔区、受精囊孔区均有乳突；新物种前列腺发达，块状分叶组成，皮质远盲蚓前列腺退化；新物种受精囊盲管较短，皮质远盲蚓受精囊盲管细长。
Table 1. Comparison of morphological characteristics of three new species
表1. 3个新物种的形态特征对比
形态特征 |
龙门远盲蚓 |
暗色远盲蚓 |
黄褐远盲蚓 |
外 部 特 征 |
成体体长 |
76 mm |
44 mm |
47 mm |
环带宽度 |
3.8 mm |
2.8 mm |
3.6 mm |
体节数 |
70 |
102 |
66 |
口前叶 |
1/2上叶式 |
1/2上叶式 |
1/2上叶式 |
背孔 |
11/12 |
5/6 |
5/6 |
环带 |
XIV~XVI节，光滑隆起，无刚毛，无背孔 |
XIV~XVI，光滑隆起，无刚毛，有背孔痕迹 |
XIV~XVI节，光滑隆起，无刚毛，无背孔 |
刚毛数 |
28/III、30/V、34/VIII、58/XX、56/XXV，受精囊孔间8 (VI)、10 (VII)、12 (VIII)，雄孔间13 (XVIII) |
26/III、26/V、40/VIII、32/XX、30/XXV，受精囊孔间10 (VI)、12 (VII)、14 (VIII)，雄孔间7 (XVIII) |
22/III、28/V、30/VIII、32/XX、30/XXV，受精囊孔间10 (VI)、11 (VII)、12 (VIII)，雄孔间7 (XVIII) |
雄孔 (腹侧) |
1对，位于XVIII节腹侧两边，雄孔间距约1/3节周长，位于1个中等偏小的圆形平顶突起上，有一圈皮褶包围 |
1对，位于XVIII节腹侧两边，孔间距略大于1/4节周长，各位于1个椭圆形小突起上 |
1对，位于XVIII节腹侧两边，两孔腹侧间距略大于1/4节周长，各位于一个中等大小的圆形突起上；圆形突起周边形成白色椭圆形腺区 |
雌孔 (腹侧) |
1个，位于XIV节腹侧中央，卵圆形，乳白色 |
1个，位于XIV节腹侧中央，卵圆形，乳白色 |
1个，位于XIV节腹侧中央，卵圆形，乳白色 |
受精囊孔 (腹侧) |
4对，位于5/6~8/9节间，小眼状，孔区清晰，孔间距1/3节周长，紧贴8/9节间沟后方，第IX节刚毛环前有1对间距为1/4节周长的圆形小乳突 |
4对，位于5/6~8/9，小眼状，孔区清晰，孔间距略大于1/4节周长 |
4对，位于5/6~8/9节间，小眼状，孔区清晰，孔间距略大于1/4节周长 |
内 部 特 征 |
隔膜 |
5/6~7/8肌肉质；10/11~13/14较厚；8/9~9/10缺失 |
5/6~7/8肌肉质，10/11~13/14较厚，8/9~9/10缺失 |
5/6~7/8厚肌肉质，10/11-13/14较厚，8/9~9/10缺失 |
砂囊 |
长桶状，前细后粗，IX、X节 |
长桶状，前细后粗，IX、X节 |
长桶状，位于IX、X节 |
小肠 |
自XV节开始膨大 |
自XV节开始膨大 |
自XV节开始膨大 |
盲肠 |
指状，单式，起于XXVII节，位于XXVII~XXIV，背腹缘均较光滑 |
指状，过渡态，起于XXVII节，位于XXIII~XXVII，背缘较光滑，腹缘有6个指状小囊 |
指状，单式，起于XXVII节，位于XXIII~XXVII， |
心脏 |
4对，位于X~XIII节，较发达 |
4对，位于X~XIII节，较发达 |
4对，位于X~XIII节，较发达 |
精巢囊 |
2对，位于X、XI节，卵圆形，发达 |
2对，位于X、XI节，较发达 |
2对，位于X、XI节，均发达，第一对较第二对发达 |
储精囊 |
2对，位于XI~XIII节，发达 |
2对，位于XI、XII，较小 |
2对，位于XI、XII，发达 |
前列腺 |
退化，前列腺管呈“6”字形，位于XVIII~XIX节，末端膨大连于体壁 |
XVI~XXI，发达，厚，块状分叶组成；前列腺管呈倒“U”形，位于XVIII节，末端膨大连于体壁 |
XV~XXI，非常发达，厚，块状分叶组成；前列腺管呈倒“U”形，位于XVII~XIX节，末端膨大连于体壁 |
受精囊 |
4对，位于VI~IX节，主体长1.2 mm，坛囊前三对桃心形，第四对长卵圆形，坛管粗，约为坛囊的1/2长，无盲管 |
4对，位于VI~IX节，主体长约1.2 mm，坛囊卵圆形，坛管约为坛囊的1/2长，盲管约为主体的2/3长，盲管柄弯曲，前端1/4膨大为长卵圆形纳精囊 |
4对，位于VI~IX节，主体长约1.4 mm，坛囊为长卵圆形，坛管约为坛囊的1/6长，盲管约为主体的1/3长，盲管柄细长弯曲，前端1/3膨大为长卵圆形纳精囊 |
4. 结论
基于形态学分析方法与GenBank分子数据比对，结果说明A. longmenmontis Dong & Jiang sp. nov.，A. impolitus Dong & Qiu sp. nov.与A. fulvidus Dong & Sun sp. nov.不同于以往采集或记录的物种，为新物种。
致 谢
感谢上海交通大学邱江平教授的研究团队在野外采集工作中做出的贡献。
基金项目
国家科技基础资源调查专项课题(2018FY100301)。成都工业学院校级科研项目，人才项目(博士基金)114/235126。
NOTES
*通讯作者。