1. 引言

蜡样芽孢杆菌菌群(Bacillus cereus group)在自然界中广泛存在，其中研究最多的细菌是炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌[1]。蜡样芽孢杆菌菌群细菌的菌体成杆状，长度一般是1.8~7.8 μm，宽度一般是0.2~2.0 μm，生长温度范围是4℃~50℃，最适生长温度一般在30℃，生长盐度(NaCl)范围一般是0%~9% [2] [3]。其形成的内生芽孢对高温、低温、pH以及其他环境压力有很强的耐受性，因此蜡样芽孢杆菌菌群细菌在自然界中分布十分广泛，腐烂的有机物、动植物、食品、淡水、海水、以及无脊椎动物胃肠道中都有这些菌群分布，甚至可以在自然栖息地之外发现[4]-[6]。蜡样芽孢杆菌的致病性是建立在一系列致病因素的基础上的，这些致病因素远未被了解，导致一系列人类疾病[7] [8]。各种蜡样芽孢杆菌外毒素与致病性有关，到目前为止，四种蜡样芽孢杆菌外毒素已被明确地证实与食物中毒有关。这些毒素对人类、家畜和野生动物等的健康造成严重威胁，造成一定的社会、经济和环境负担[9] [10]。

关于蜡样芽孢杆菌的相关研究在食物源和环境源中的报道屡见不鲜，但医疗环境中的相关研究还不是很多，本实验通过研究医疗环境中境蜡样芽孢杆菌的污染情况，分析其生物特征以及耐药情况。为今后潜在的致病性蜡样芽孢杆菌所引发的毒性机制研究提供了借鉴和参考。提高人们对医疗环境源中蜡样芽孢杆菌消杀的重视，加强医疗微环境卫生的管理。

2. 材料方法

2.1. 实验菌株

医院各消杀环境中取样分离培养鉴定的一株蜡样芽孢杆菌ZJ4。

2.2. 扫描电镜及透射电镜观察细菌形态结构

将分离纯化的菌体挑入含有10 mL NB液体培养基中，振荡培养12 h；培养后吸取800 μL菌液离心，3000 rpm离心3 min，去上清，加入500 μL PBS洗2~3次。随后向沉淀中加入4%戊二醛1 mL，4℃静置过夜；3000 rpm离心3 min，去上清；随后向沉淀中缓慢加入2%戊二醛500 μL，4℃放置1 h；3000 rpm离心3 min，使用20%，50%，80%，100%乙醇梯度脱水，每次脱水10 min，3000 rpm离心3 min；用叔丁醇置换乙醇2~3次，乙醇菌液离心后，去上清，加200 μL 100%叔丁醇4℃放置30 min，利用扫描电镜JSM-7800F透射电镜JEM-2100分析蜡样芽孢杆菌菌体形态和结构特征。

2.3. 生长曲线及生化检测

利用NAOH、HCL、柠檬酸等配制好不同pH (5~10)的NB培养基对细菌ZJ4进行培养观察。并在特定时间段检测OD600的吸光度，绘制蜡样芽孢杆菌ZJ4在不同pH下的生长曲线。将活化后的蜡样芽孢杆菌，取5 µL菌悬液滴在琼脂含量为0.3%和0.5%的LB培养基平板中央，正放在30℃恒温培养箱中过夜培养，观察蜡样芽孢杆菌的泳动(Swimming)和涌动(Swarming)拍照记录。

溶血性检测：将活化后的蜡样芽孢杆菌及其上清液直接接种于血琼脂平板上，设置PBS对照，于28℃过夜培养，观察细菌及上清液溶血情况。

2.4. 基因组DNA提取及进化树构建

根据Vazyme FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit DC103说明书提取细菌ZJ4基因组DNA，进行电泳检测。利用细菌16S rDNA基因通用引物进行16S rDNA序列PCR扩增。扩增体系(总体积：50 μl)如下：ddH₂O，16 μl；引物8 F，2 μl；引物U1492R，2 μl；2 × Rapid Taq Master Mix，25.0 μl；模板DNA，5 μl；放于PCR仪上，设置程序95℃预变性，5 min；95℃变性，50 sec；58℃退火，20 sec；72℃延伸，40 sec；35个循环；72℃延伸，5 min。将PCR产物送样测序。将DNA测序结果输入到NCBI网站进行序列比对，利用mega软件(version 11)进行进化树构建。

2.5. 全基因组测序

收集足量的菌体后，送样至上海美吉生物科技有限公司进行全基因组测序，并将测序结果利用COG、GO、KEGG通路分析工具、CAZy、TCDB、CARD进行对比分析，获得相应基因组注释信息。

3. 结果与分析

3.1. 细菌形态鉴定结果

通过形态鉴定实验可知细菌ZJ4菌落较大，呈乳白色，表面干燥，蜡状不光滑，边缘不规则根据透射电镜结构可以看出ZJ4细胞壁有清晰的三层结构，周围有细小的鞭毛；扫描电镜可以准确地观察出ZJ4的立体形态为杆状表面粗糙不光滑(图1)。

3.2. 细菌生长曲线及运动性与溶血活性鉴定

根据细菌在不同pH (5~10)生长情况，绘制生长曲线(如图2(A))，当pH在7左右时ZJ4生长状态最好。当pH在6.0以下时细菌生长受到严重抑制，而当pH在7以上时ZJ4虽不如pH = 7时生长旺盛，仍可以继续生长。故可得出细菌ZJ4是一种耐碱不耐酸的菌。同时该菌的平缓生长期在0~6 h时，对数生长期在6~18 h时，稳定生长期在18~24 h时，24 h之后进入衰败期。

30℃过夜培养后，根据图2(B)可以看出该菌在0.3%琼脂的LB平板培养基中飞速增长，在0.5%琼脂LB平板培养基中生长相对平缓；图2(C)中细菌ZJ4可以产生透明圈，表明细菌能够溶解血琼脂培养基，具有溶血功能。其分泌的上清液也有一些溶血现象(图2(D))，表明细菌ZJ4的基因组中可能含有溶血素基因，并且能够分泌溶血蛋白。

Figure 1. Morphological characteristics of Bacillus cereus strain ZJ4 revealed by electron microscopy. (A) Transmission electron microscopy (TEM) image of ZJ4; (B) Scanning electron microscopy (SEM) image of ZJ4

图1. 蜡样芽孢杆菌ZJ4显微形态特征。(A) ZJ4透射电子显微镜图像(TEM)；(B) ZJ4扫描电子显微镜图像(SEM)

Figure 2. Growth characteristics, motility, and hemolytic activity of bacterial strain ZJ4. (A) Growth curves of ZJ4 under different pH conditions; (B) Swarming ability assay of ZJ4; (C) Swimming ability determination of ZJ4; (D) Hemolytic activity analysis of ZJ4

图2. 细菌ZJ4生长特性、运动能力及溶血活性分析。(A) 不同pH条件下ZJ4的生长曲线；(B) ZJ4涌动能力检测；(C) ZJ4泳动能力测定；(D) ZJ4溶血活性分析

3.3. 16S rDNA序列比对与进化树的构建结果

16S rDNA基因PCR扩增测序结果显示细菌ZJ4 16S rDNA大小为1457 bp (图3(A))。进化树结果表明细菌ZJ4与2TM-6、BC-1、JY2蜡样芽孢杆菌的亲缘关系较近(图3(B))。

(A) (B)

Figure 3. Molecular identification and phylogenetic analysis of strain ZJ4 using 16S rDNA gene. (A) Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA fragment; (B) Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

图3. ZJ4菌株16S rDNA基因鉴定与系统发育分析。(A) 16S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；(B) 基于邻接法构建的系统进化树

3.4. 蜡样芽孢杆菌全基因组测序分析

全基因组测序结果显示ZJ4的基因组大小为584,719,145 bp，编码DNA序列(CDS)是6063个，含有107个tRNA基因，45个rRNA基因。在COG分类中，功能未知的单基因最多有1136种。在正常的生理细胞代谢有关DNA序列中，最大的COG组是氨基酸转运和代谢，含有365个单基因。在GO注释中，细胞组成共富集到2329个基因，分子功能中共富集到3304个基因，另外还有2973个基因被富集到生物学进程类别中。KEGG注释分析结果，有2471个基因被富集到42个KEGG代谢通路中。主要为代谢、环境信息处理、细胞过程等途径。基因组岛分析中结果表明ZJ4有14个基因组岛，染色体上有10个，质粒上有4个，共计含有编码基因数量为222个。

如图4(A)所示ZJ4在CAZymes中注释最多的是碳水化合物酯酶，有47个基因，其次为糖基转移酶，32个基因，糖苷水解酶，28个基因，辅助活性酶，16个基因，以及多糖裂解酶，1个基因，总计ZJ4碳水化合物酶基因数量共为124个。如图4(B)所示ZJ4转运蛋白共有七类，转运蛋白上基因数量中被注释最多的为主动转运蛋白，412个基因；其次为化学电位驱动转运蛋白，280个基因；通道蛋白，65个基因；转运蛋白组，37个基因，综合ZJ4转运蛋白共有948个基因。耐药基因预测结果表明其共有353个耐药基因(图4(C))，分布于大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、头霉素类抗生素等抗生素耐药种类。选取12种不同类型的抗生素进行最小抑菌实验，结果表明蜡样芽孢杆菌对大环内酯类抗生素耐药性最强。

4. 讨论

本研究从医疗环境中分离出来的菌株ZJ4属于蜡样芽孢杆菌属，与蜡样芽孢杆菌2TM-6亲缘关系较近，在0.3%琼脂的LB平板培养基生长状态好，具有溶血活性，16S rDNA大小为1457 bp。利用Illumina和单分子PacBio结合进行全基因组结果显示ZJ4的基因组大小为584,719,145 bp，编码DNA序列(CDS)是6063个，这与刘珊等人研究的菌株GW-01 [11]基因组大小为5,244,145 bp，共编码5314个基因，在基因组岛分析中ZJ4基因组中共预测到了相关基因组岛14个，10个位于ZJ4染色体组上，4个位于质粒基因组中，共计含有编码基因数量为222个。基因组岛的功能通常只与抗生素抗性以及共生适应性等特性

(A) (B)

(C)

Figure 4. Functional genome annotation analysis of strain ZJ4. (A) Annotation profile of carbohydrate-active enzymes (CAZymes); (B) Functional classification of transport proteins; (C) Distribution characteristics of antibiotic resistance genes

图4. ZJ4菌株功能基因组注释分析。(A) 碳水化合物活性酶注释分布；(B) 转运蛋白系统功能分类；(C) 抗生素耐药基因分布特征

相关[12]，但是在致病性病原菌中，毒力岛作为基因组岛的一个亚类，对病原菌的毒性是至关重要的[13]。基因组岛是细菌染色体中通过基因水平转移获得的DNA片段，通常携带抗生素抗性基因，毒力基因等[14]。在医疗环境内长期使用低剂量抗生素可能会激活细菌ZJ4基因组岛上的SOS响应元件，促进基因重组与抗性累积。另外，这些基因组岛上的基因也可能在不同环境压力下被激活或者转移，以此增强细菌本身的环境适应性和进化潜力[15]。

通过COG、GO、KEGG等数据库完成了功能注释与比对分析可知蜡样芽孢杆菌ZJ4具有较强的代谢水平和生物学功能。其中碳水化合物酶基因数量共为124个，注释最多的是碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases, CEs) 47个基因；转运蛋白共有七类，948个基因，其中注释最多是动转运蛋白(Primary Active Transporters)有412个基因。耐药基因共计353个，分为11类，其中占比分布最大的在大环内酯类抗生素(macrolide antibiotic)有52个基因，由此可见蜡样芽孢杆菌ZJ4能够对多种抗生素产生耐药性。

由此可见本实验对医疗环境源中蜡样芽孢杆菌的了解已取得初步成功，有关蜡样芽孢杆菌在医疗环境下生物污染的解决仍在同步进行。通过对毒力基因进行深入分析，我们能够识别出与已知的蜡样芽孢杆菌毒力因子不同的独特遗传特征。这些新型毒力基因为蜡样芽孢杆菌提供更强的病原性和适应性，使其在环境中具有更高的存活和传播潜力[16]-[19]。通过全基因组测序以及生信分析，为抑制蜡样芽胞杆菌在医疗环境中的存在提供相关基础。进一步引起对医疗环境中病原微生物污染的关注，加强对医疗环境的安全管理，防止获得性感染的发生。

5. 展望

通过本研究，对医疗微环境中的蜡样芽孢杆菌的基因组信息及生物学特性取得一定研究成果，但仍需深入研究其功能基因。这为未来针对蜡样芽孢杆菌的防治策略提供新的方向。后续可根据基因组测序鉴定的毒力基因进一步深入探究，如研究不同种毒力基因的致病机制，以及位于质粒上的毒力基因在进化、水平转移中的机制，从多角度深化对蜡样芽孢杆菌的研究。根据蜡样芽孢杆菌基因功能，结合其转录、翻译等实验研究更深层次地探究其具体功能。蜡样芽孢杆菌耐药性为研制针对蜡样芽孢杆菌的专一性抗生素提供关键的数据支持，从而为解决蜡样芽孢杆菌对在医疗环境的污染问题作出贡献。

基金项目

本文系滁州学院2024年度大学生创新创业训练计划，项目编号：2024CXXL127。安徽省高等学校科学研究项目，项目编号：2024AH051415，滁州学院科研启动基金项目，项目编号：2024qd43。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献