1. 引言

乳腺癌已成为仅次于肺癌的第二大常见恶性肿瘤，并且是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，对全世界的生命构成威胁[1] [2]。女性一生患乳腺癌的风险为12%，并且乳腺癌的死亡率正在上升。早期诊断和癌症预防意识的提高降低了死亡率，但癌症的发病率仍然很高，HER2+占所有乳腺癌病例的25%~30%，具有高度侵袭性，易转移，且对治疗反应复杂[3]。近年来，肿瘤微环境(TME)在乳腺癌发生发展中的作用受到广泛关注[4]。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术能够揭示不同细胞类型的基因表达特征，从而更精准地解析肿瘤组织的异质性及细胞通讯网络[5] [6]。

已有研究表明，HER2+乳腺癌微环境中的免疫细胞浸润、成纤维细胞激活及细胞间通讯重塑可能对癌症进展及治疗耐受性产生重要影响[7] [8]。然而，目前针对HER2+乳腺癌的单细胞水平研究仍较为有限，尤其是不同细胞类型间的信号通讯模式及其对肿瘤微环境的调控作用尚待深入探讨。本研究基于GEO数据库GSE161529数据集，利用scRNA-seq分析HER2+乳腺癌组织与正常乳腺组织的细胞组成、基因表达及细胞间通讯，以期揭示HER2+乳腺癌微环境的关键特征，并为精准治疗提供理论支持。

2. 方法

2.1. scRNA-seq数据来源

本研究的人乳腺癌单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据来源于Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中的GSE161529数据集。共选择6例样本，其中PT组为3例HER2+乳腺癌患者，NM组为3例健康乳腺组织样本。

2.2. scRNA-seq差异表达分析与细胞类型注释

本研究利用Seurat软件包(v4.3.0)对单细胞转录组数据进行全面分析。数据预处理后，根据UMI计数(nCount_RNA 300-8000)、线粒体基因比例(percent.mt < 10%)、和基因数(nFeature_RNA > 200)进行质量控制，最终筛选保留了34,526个高质量细胞。为整合数据并消除批次效应的干扰，我们采用Harmony软件包进行批量效应校正。将PT1和PT2组样本加载为Seura对象后，对数据进行对数归一化和缩放，并使用FindVariableFeatures函数提取前2000个最具变异的基因。随后，利用主成分分析(PCA)对基因表达数据进行降维分析，并依据肘部图(ElbowPlot)选择前10个主成分(PCs)。通过FindNeighbors和FindClusters函数进行聚类分析，分辨率参数设为0.5。最终使用均匀流形逼近与投影(UMAP)方法可视化聚类结果。细胞类型的鉴定基于FindAllMarkers函数筛选的差异表达基因，并结合CellMarker和PanglaoDB数据库中的已知标记基因及文献报道的细胞特异性表达模式，对主要细胞类型进行了注释。

2.3. GO通路富集分析

针对不同细胞类型，我们进一步分析了PT和NM组间的差异表达基因，并进行功能注释和通路富集分析。首先，利用FindMarkers函数筛选各细胞类型中显著差异表达的基因，参数设置为min.pct = 0.01、test.use = “wilcox”和logfc.threshold = 0.25，再通过参数avg_log2FC的正负值来区分上下调基因。随后，采用R包clusterProfiler (v3.12.0)对这些差异基因进行基因本体(GO)功能富集分析，并用Dotplot()将结果可视化，显示了不同细胞类型中富集的生物通路。

2.4. 细胞–细胞相互作用分析

为进一步探讨PT和NM组间的细胞通讯变化，本研究使用CellChat软件包(v1.1.3)进行细胞–细胞相互作用分析。分析以PT和NM组的原始表达矩阵为输入，通过CellChatDB数据库构建细胞通讯网络。对每组中不同细胞类型之间的配体–受体相互作用进行了量化，并计算配体–受体对的表达评分。采用统计学方法评估每个配体–受体对的显著性，以p < 0.05为阈值筛选关键相互作用。

2.5. 统计分析

所有图形展示和统计分析均基于R软件(v4.2.0)完成。本研究中涉及的所有方法均通过公开的R包实现，保证了分析流程的可重复性。

3. 结果

3.1. HER2+乳腺癌与正常乳腺组织中细胞类型及比例的差异分析

本研究基于GEO数据库数据集GSE161529，包含6例样本，其中PT组为3例HER2+乳腺癌患者，NM组为3例健康乳腺组织样本。经过严格的质量控制和批次效应校正后，共鉴定出24,329个PT组细胞和10,197个NM组细胞，并筛选出24,506个基因用于后续分析。UMAP可视化结果显示，单细胞数据成功划分为16个细胞簇(图1(A))，进一步基于特异性基因表达鉴定出8种主要细胞类型(图1(B)，图1(C))，包括B细胞(CD79A)、嗜碱性粒细胞(OXTR)、内皮细胞(PECAM1)、上皮细胞(KRT19)、成纤维细胞(PDGFRB)、肥大细胞(TPSAB1)、髓系细胞(CD68)以及T/NK细胞(CD3D)。通过比较各样本中不同细胞类型的比例(图1(D))及PT组与NM组的细胞组成差异(图1(E))，结果显示，与NM组相比，PT组中B细胞、T/NK细胞、上皮细胞和髓系细胞的比例显著升高，而内皮细胞、成纤维细胞和嗜碱性粒细胞的比例明显下降，肥大细胞的比例无显著变化。

Figure 1. Cell types and proportions. (A) UMAP maps of 11 cell clusters identified in 34,526 cells. Each point represents a cell; (B) The dot plot displays the expression of known gene markers in different cell types; (C) UMAP maps stained by major cell types in this study; (D) The proportion of each cell type in each sample; (E) The proportion of cell types in different groups

图1. 细胞类型及比例。(A) 在34,526个细胞中鉴定出的11个细胞簇的UMAP图。每个点代表一个细胞；(B) 点图显示了已知基因标记在不同细胞类型中的表达；(C) 本研究中按主要细胞类型着色的UMAP图；(D) 每个样品中每种细胞类型的比例；(E) 不同组中细胞类型的比例

3.2. PT和NM组差异基因分析及功能富集结果

进一步比较了HER2+乳腺癌组织(PT组)与正常乳腺组织(NM组)的基因表达差异，并通过火山图(图2(A))展示了显著上调和下调的基因。结果表明，与NM组相比，PT组中存在大规模的基因表达变化，其中显著上调的基因(红色)包括IGHG2、IGHG4、MS4A1、TRDC、DCD等，而显著下调的基因(蓝色)主要有SERPINB4、IGFBP1、KRTAP3-2等。值得注意的是，MS4A1作为B细胞标志物的表达上调，表明乳腺癌组织可能存在B细胞活化增强的现象，而TRDC作为T细胞受体(TCR)相关基因的上调，则提示乳腺癌微环境中T细胞的变化。此外，部分下调基因(如SERPINB4，IGFBP1)可能涉及正常乳腺组织的稳态维持，其表达水平的下降可能影响细胞正常功能，并在乳腺癌的发生发展过程中发挥作用。为了进一步解析这些差异基因的功能，采用GO富集分析分别对显著下调和上调的基因进行通路注释(图2(B)、图2(C))。结果显示，PT组中下调基因主要富集于核糖体生物合成、RNA代谢、RNA加工及蛋白质定位等过程，提示RNA代谢和蛋白合成调控异常；上调基因则显著富集于免疫应答调控、单核细胞与淋巴细胞分化、T细胞活化及抗原受体介导的信号通路，反映肿瘤免疫微环境的重塑。

Figure 2. Differential gene analysis and functional enrichment results. (A) The volcano map of the PTvsNM group displays the top ten differentially expressed genes. (B) Functional enrichment analysis of GO molecules downregulated by PTvsNM group. (C) Functional enrichment analysis of GO molecules upregulated in PTvsNM group

图2. 差异基因分析及功能富集结果。(A) PTvsNM组的火山图，显示前十差异基因；(B) PTvsNM组下调基因GO分子功能富集分析；(C) PTvsNM组上调基因GO分子功能富集分析

3.3. HER2+乳腺癌与正常乳腺组织中细胞间通讯差异及配受体模式分析

通过比较HER2+乳腺癌组织(PT组)与正常乳腺组织(NM组)之间的细胞间信号转导特征，发现两组在细胞相互作用上存在显著差异。结果显示，PT组的细胞间相互作用数量更多，整体相互作用强度更高(图3(A))，表明HER2+乳腺癌微环境中的细胞通讯更加活跃。信息流与通路分析(图3(B))进一步揭示，PT组中特别活跃的通路包括FN1、MK、MHC-II、SPP1、GALECTIN、PERIOSTIN、NOTCH、ITGB2、CD46、BAFF、PTPRM、PECAM1、CDH5、PTN、APP、ESAM、COLLAGEN、SEMA3和TENASCIN，涉及细胞外基质重塑、炎症调控及免疫逃逸；NM组则以CDH、CDH1、VISFATIN、DESMOSOME、VEGF、CLEC、EDN、FGF、MP2、CALCR、ANGPT、ANGPTL和SELE通路为主，主要参与维持组织稳态、血管生成及细胞黏附。细胞通讯网络分析(图3(C))显示，PT组的内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和髓系细胞之间的通讯显著增强，提示这些细胞类型可能在HER2+乳腺癌的发生发展过程中发挥关键作用。细胞通讯强度分析(图3(D))进一步表明，成纤维细胞具有最强的信号输出能力，而髓系细胞和嗜碱性粒细胞的信号输入强度更高，这可能与肿瘤微环境的免疫重塑及炎症调节密切相关。

Figure 3. Overall differences in cell-cell communication. (A) Comparison of overall intercellular communication volume and intensity differences between PT group and NM group. (B) The bar chart shows the differences in enriched signaling pathways between the PT group and the NM group. (C) Comparison of cell-cell communication differences between PT group and NM group. (D) Comparison of the strength of outgoing and incoming interactions between PT1 and PT2 groups in 2D space

图3. 细胞通讯的总体差异。(A) PT组和NM组之间整体细胞间通信量和强度差异的比较；(B) 柱状图显示了PT组和NM组之间富集信号通路的差异；(C) PT组和NM组细胞通讯量差异比较；(D) 2D空间中PT1和PT2组之间传出和传入相互作用强度的比较

3.4. 内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞和髓系细胞与肥大细胞网络和配体受体的差异

利用CellChat分析PT组与NM组不同细胞类型间的通讯变化(图4(A)~(D))，结果显示内皮细胞 (Endothelial)、上皮细胞(Epithelial)、成纤维细胞(Fibroblasts)和髓系细胞(Myeloid)与肥大细胞(Mast)之间的通讯在PT组中显著增强，提示HER2+乳腺癌中细胞通讯模式发生明显改变。进一步关键配体–受体对分析(图4(E))显示，MIF-(CD74 + CD44)通路在PT组内上皮、内皮和成纤维细胞与肥大细胞之间显著增强，可能促进肿瘤相关炎症及免疫调控；同时，FN1-CD44通路的增强提示细胞外基质在肿瘤进展和细胞迁移中发挥重要作用；此外，APP-CD74通路主要在内皮细胞与肥大细胞之间活跃，PT组中该通路通讯概率较高，暗示APP可能参与肿瘤微环境的炎症调控。

Figure 4. Differences in receptor coordination for cell-cell communication. (A) Comparison of endothelial cell-cell communication differences between PT group and NM group; (B) Comparison of epithelial cell-cell communication differences between PT group and NM group; (C) Comparison of differences in fibroblast cell-cell communication between PT group and NM group; (D) Comparison of myeloid cell-cell communication differences between PT and NM groups; (E) Compare the ligand-receptor pairs involved in mast cell communication between four cell types in the PT and NM groups

图4. 细胞通讯的配受体差异. (A) PT组和NM组内皮细胞通讯差异比较；(B) PT组和NM组上皮细胞通讯差异比较；(C) PT组和NM组成纤维细胞通讯差异比较；(D) PT组和NM组myeloid细胞通讯差异比较；(E) 比较PT组和NM组中四种细胞类型对mast细胞通讯中涉及的配体–受体对

4. 讨论

本研究基于单细胞转录组测序(scRNA-seq)系统解析了HER2+乳腺癌(PT组)与正常乳腺组织(NM组)的细胞组成及通讯模式，揭示了该亚型乳腺癌微环境的独特特征。结果显示，HER2+乳腺癌组织在细胞比例、关键信号通路活化及细胞通讯模式方面均发生显著变化，这些变化可能在癌症进展和肿瘤微环境(TME)塑造过程中发挥关键作用。

与NM组相比，PT组的细胞组成呈现明显重塑。B细胞和T/NK细胞的增加提示HER2+乳腺癌组织内免疫细胞浸润增强，可能反映机体对肿瘤细胞的免疫应答[9]。然而，髓系细胞(Myeloid)的升高，尤其是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓系来源抑制细胞(MDSCs)的富集，表明HER2+乳腺癌微环境可能存在免疫抑制现象[10]。已有研究表明，TAMs可分泌IL-10、TGF-β等细胞因子抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤生长及转移[11]，而MDSCs则通过抑制CD8+T细胞和NK细胞功能，进一步削弱抗肿瘤免疫应答[12]。此外，PT组中上皮细胞比例增加，可能反映HER2+乳腺癌细胞的克隆扩增与恶性增殖特性，这与HER2介导的PI3K/AKT和MAPK途径激活密切相关[13]。相反，内皮细胞和成纤维细胞的减少可能提示肿瘤组织的血管生成和基质结构发生变化，进而影响癌细胞的侵袭和迁移能力[14]。值得注意的是，嗜碱性粒细胞(Basophils)的减少可能表明HER2+乳腺癌微环境的炎症调控发生变化[15]，而肥大细胞(Mast)比例相对稳定，尽管已有研究显示其可能通过释放趋化因子促进肿瘤进展[16]。

在转录组水平上，PT组上调基因显著富集于免疫相关通路，包括T细胞分化、抗原呈递和炎症反应(GO分析结果)，提示肿瘤微环境可能处于免疫激活状态[17]。然而，这种激活未必意味着有效的抗肿瘤应答，反而可能反映“免疫耗竭”(immune exhaustion)现象，即在免疫抑制机制作用下，T细胞功能逐渐下降，导致肿瘤免疫逃逸[18]。此外，下调基因主要涉及RNA代谢、蛋白翻译及核糖体生物合成等过程，表明HER2+乳腺癌细胞可能通过降低蛋白合成需求来适应缺氧、低营养等恶劣的肿瘤微环境，从而维持存活[19]。

CellChat分析揭示，HER2+乳腺癌组织的细胞通讯显著增强，尤其是FN1-CD44、MIF-(CD74 + CD44)及APP-CD74途径的激活，进一步支持了HER2+乳腺癌微环境的重塑。我们发现FN1、MIF和APP相关通路在HER2+乳腺癌中均显著上调，其中FN1 (纤维连接蛋白1)与CD44受体的相互作用可能促进细胞外基质(ECM)重塑，从而增强癌细胞的侵袭能力，并可作为潜在的生物标志物[20]。MIF (巨噬细胞迁移抑制因子)通过CD74 + CD44受体复合体调控炎症反应，并在多种肿瘤类型中促进免疫抑制微环境的形成，抑制抗肿瘤T细胞功能，同时诱导MDSCs的积累[21]。此外，APP (淀粉样前体蛋白)在PT组中与CD74受体的相互作用增强，提示其可能通过调节炎症相关信号通路影响HER2+乳腺癌的进展[22]。HER2+乳腺癌微环境表现出细胞组成重塑、免疫抑制信号增强以及ECM重塑的特征，这些变化共同驱动肿瘤的进展和免疫逃逸。

5. 结论

本研究基于单细胞转录组数据，系统解析了HER2+乳腺癌组织的细胞组成、基因表达及细胞通讯网络，揭示了该亚型乳腺癌特有的免疫微环境特征。我们的研究表明，HER2+乳腺癌不仅表现出细胞外基质重塑和炎症调节的增强，还可能通过MIF、FN1和APP相关通路促进免疫逃逸和肿瘤进展。

基金项目

国家自然科学基金项目(32160147, 32460152)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献