摘要: 本研究讨论了绿原酸(CGA)对黄喉拟水龟总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)含量及代谢相关基因表达的影响。将450只健康无损伤的黄喉拟水龟(初始体重为125.47 ± 5.13 g)随机分成5组，每组3个重复，每个重复30只龟，在基础饲料中分别添加0 mg/kg (Con)、100 mg/kg (CGA1)、200 mg/kg (CGA2)、400 mg/kg (CGA4)、800 mg/kg (CGA8)的CGA，实验周期为60 d。结果表明，与对照组(Con)相比，200 mg/kg的CGA可显著提高血清和肝脏的TP含量、降低血清TG含量，400 mg/kg的CGA可以显著减少血清和肝脏中的TG含量。RT-qPCR的结果显示，200 mg/kg的CGA可以显著降低肝脏AKR1D1的基因表达，并显著提高PDIA4、DERL3、CAPN9基因的表达；400 mg/kg的CGA可以显著降低肝脏AKR1D1、P450基因的表达，并显著提高DERL3基因的表达；800 mg/kg的CGA可以显著提高DERL3基因的表达。综上所述，绿原酸可提高黄喉拟水龟肝脏合成TP的能力、降低血清和肝脏中的TG含量，上调PDIA4、DERL3、CAPN9基因的表达、下调AKR1D1、P450基因的表达。绿原酸在黄喉拟水龟饲料中最适添加量为200~400 mg/kg。
Abstract: This study discusses the effects of chlorogenic acid (CGA) on total protein and triglycerides levels, as well as the expression of metabolism-related genes in yellow pond turtle (
Mauremys
mutica). A total of 450 healthy, undamaged yellow pond turtle (initial body weight 125.47 ± 5.13 g) were randomly divided into five groups, with three replicates per group and 30 turtles per replicate. The turtles were fed a basic diet supplemented with 0 mg/kg (Con), 100 mg/kg (CGA1), 200 mg/kg (CGA2), 400 mg/kg (CGA4), or 800 mg/kg (CGA8) of CGA for 60 days. The results showed that 200 mg/kg of CGA significantly increased TP levels in both serum and liver, and reduced TG levels in serum, while 400 mg/kg of CGA significantly reduced TG levels in both serum and liver. RT-qPCR analysis revealed that 200 mg/kg of CGA significantly decreased the expression of the liver AKR1D1 gene, while significantly increasing the expression of PDIA4, DERL3, and CAPN9 genes. Furthermore, 400 mg/kg of CGA significantly downregulated the expression of AKR1D1 and P450 genes, while significantly increasing the expression of DERL3. Additionally, 800 mg/kg of CGA significantly upregulated the expression of the DERL3 gene. In conclusion, CGA enhances the ability of yellow pond turtle to synthesize TP in the liver, reduces TG levels in both serum and liver, upregulates the expression of PDIA4, DERL3, and CAPN9 genes, and downregulates the expression of AKR1D1 and P450 genes. The optimal addition amount of CGA in the diet of Chinese soft-shelled turtles is 200~400 mg/kg.
1. 引言
杜仲(Eucommia ulmoides)是一种传统中药材，在《神农本草经》中早有记载，已有2000年的使用历史[1]。杜仲也是中国卫生部公布的药食两用植物之一，被广泛用作食品和中草药原料[2]。绿原酸(Chlorogenic acid, CGA)是杜仲的主要活性成分之一，具有促生长及抑制脂质沉淀等作用[3]。在水生动物的研究中表明，添加绿原酸可以提高鲫鱼(Carassius auratus) [3]、草鱼(Ctenopharyngodon idella) [4]的生长性能。还有研究表明适当浓度的绿原酸可提高大口黑鲈(Micropterus salmoides) [5]和鲫鱼[3]肝脏中的脂质代谢基因SREBP-1c、DGAT2的表达，降低肝脏中胆固醇和甘油三酯的含量。在畜牧动物中绿原酸也有显著的效果，周昊等人[6]的研究发现在育肥猪的日粮中添加绿原酸可以显著提高其血清中的总蛋白和白蛋白，但对甘油三酯和总胆固醇则无显著影响。在田艳等人[7]的研究中发现绿原酸可以通过提高HMGCR、ACAT2、ABCA1、ABCG5、APOA1基因和SREBF2、ACAT2、ABCA1蛋白的表达来缓解高胆汁酸环境带来的牛肝细胞胆汁酸蓄积的问题。目前，在动物饲料中添加绿原酸来提高机体免疫力、促进动物生长和改善肝肠健康已成为一种趋势。但绿原酸对硬壳淡水龟蛋白及脂质代谢的影响尚不清楚。
黄喉拟水龟(Mauremys mutica)是一种硬壳淡水龟，隶属于龟鳖目(Testudines)、潮龟科(Geoemydidae)、拟水龟属(Mauremys)，分布于日本、越南以及中国的中南部地区。目前，黄喉拟水龟是中国交易量最大的淡水龟类之一，也是一种重要的新兴水产养殖品种，在营养、药物、观赏和经济方面具有重要价值，市场前景广阔。在养殖过程中，养殖动物常常因为过量食用腐败变质的鱼、猪肠等饵料导致脂肪代谢异常、肝脏存储脂肪过多等问题[8]；同时动物血清蛋白水平反映肝脏的蛋白质合成能力[9]，血清蛋白水平的提升有利于维持机体的代谢和生理功能[10]，因而加强黄喉拟水龟蛋白及脂质代谢能力有利于提高其养殖效益。已知绿原酸对养殖动物具有促生长及抑制脂质沉淀等作用[11]，但关于绿原酸在黄喉拟水龟饲料中的添加应用还缺乏研究。本研究以黄喉拟水龟为研究对象，在饲料中添加不同水平的绿原酸，通过对血清及肝脏中总蛋白、甘油三酯含量以及肝脏中蛋白、脂质代谢相关基因的测定，探究在饲料中添加绿原酸对黄喉拟水龟蛋白和脂质沉淀的影响，为黄喉拟水龟绿色饲料开发提供理论依据，助力黄喉拟水龟养殖产业健康发展。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验龟
实验中使用的450只黄喉拟水龟购自中国南宁市碧艳龟鳖经营部，初始体重为125.47 ± 5.13 g。
2.1.2. 实验饲料
实验所需的基础饲料原料购自佛山市顺德区全兴水产饲料有限公司。在饲料中分别添加0 (对照组，Con)、100 (CGA1)、200 (CGA2)、400 (CGA4)和 800 (CGA8) mg/kg的CGA，制成5组饲料，每组饲料营养成分如表1所示。
Table 1. Feed ingredients and conventional nutritional composition
表1. 饲料原料及常规营养组成
原料组成(%) |
Con |
CGA1 |
CGA2 |
CGA4 |
CGA8 |
鱼粉 |
38 |
38 |
38 |
38 |
38 |
豆粉 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
花生饼 |
11 |
11 |
11 |
11 |
11 |
鱼油 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
磷脂 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
小麦粉 |
15 |
14.99 |
14.98 |
14.96 |
14.92 |
玉米粉 |
15 |
15 |
15 |
15 |
15 |
血粉 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
预混料 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
绿原酸mg/kg |
0 |
0.01 |
0.02 |
0.04 |
0.08 |
营养成分组成(干物质) |
|
|
|
|
|
粗蛋白(%) |
45.34 ± 1.23 |
45.51 ± 2.01 |
46.09 ± 1.88 |
45.18 ± 1.72 |
45.64 ± 2.31 |
粗脂肪(%) |
8.35 ± 0.95 |
8.76 ± 0.73 |
8.19 ± 1.06 |
8.59 ± 0.67 |
8.81 ± 0.84 |
粗灰分(%) |
10.43 ± 1.03 |
10.38 ± 1.48 |
10.29 ± 0.96 |
10.51 ± 1.35 |
10.49 ± 1.58 |
2.1.3. 实验龟饲养及日常管理
喂食试验前7 d，所有黄喉拟水龟均暂时驯养在一个水泥池中，使其适应饲料和养殖环境。实验开始时，黄喉拟水龟禁食24小时。随机挑选健康无损伤、体重相近的黄喉拟水龟(n = 450, 125.47 ± 5.13 g)，将其分批称重并按每箱30只的密度装入塑料箱(135 × 70 × 18厘米)中。试验期间，水温为(27.30 ± 1.10)℃。每次投喂量为黄喉拟水龟平均体重的2%，每天中午12:00投喂一次。投喂1 h后清理残余饲料，记录发病和死亡数。每个实验组依次投喂表1所示的5组饲料，每组3个重复，每个重复30只龟。饲养试验持续60 d。本研究涉及的所有动物实验均已通过广西大学动物伦理委员会审查批准，所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行，伦理批号为GXU-2024-208。
2.1.4. 样品采集与测定
每组随机选取10只龟，冷冻麻醉后采集尾静脉血，将血在4℃下放置5 h直至析出血清，然后在3000 ×g下离心10 min。收集血清样本并放置在−20℃保存。同时，解剖并快速取出肝脏样本，然后立即用液氮冷冻并在−80℃保存。
依照南京建成生物研究所提供试剂盒测定血清及肝脏中的总蛋白(Total Protein, TP)、甘油三酯(Triglyceride, TG)。用动物组织总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Tissue Kit，天根)提取肝脏总RNA，随后用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，天根)将RNA反转录为cDNA。根据NCBI发布的黄喉拟水龟β-actin序列(登录号：HQ244396.1)设计荧光定量PCR内参基因β-actin引物；基于黄喉拟水龟转录组分析获得的部分cDNA序列，使用引物设计网站 (https://www.primer3plus.com/)设计了醛酮还原酶家族1成员D1 (AKR1D1)、细胞色素P450 (P450)、乙酰辅酶A羧化酶α (ACACA)、蛋白质二硫键异构酶A家族4 (PDIA4)、Der1样域家族成员3 (DERL3)和钙蛋白酶9 (CAPN9)基因的荧光定量PCR引物(表2)。参照FastReal快速荧光定量PCR预混试剂(FastReal qPCR PreMix，天根)说明书，在LightCycle96实时荧光定量PCR仪上选择20 μL体系进行荧光定量PCR反应，体系如下，95℃ 2 min，循环程序为95℃ 5 s、60℃ 15 s，循环次数为40次。反应设3个重复。溶解曲线分析显示引物扩增产物均形成单一曲线。根据由2倍梯度稀释产生的标准曲线计算目的基因和内参基因的扩增效率，引物效率扩增接近100%，用2−ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。
Table 2. Real-time quantitative PCR (qPCR) primer sequences
表2. 荧光定量引物序列
Gene symbol |
Forward primer sequence (5’-3’) |
Reverse primer sequence (5’-3’) |
β-actin |
TCGGGAATGAAAGGTTCCGG |
CTGCATTCTGTCAGCGATGC |
AKR1D1 |
TCTTCTTGCCGCTTTCATTCAGG |
TTCCCATCGCTCAGAGGTATGC |
P450 |
AGAGCATCCTCACCTTTCATTTATCC |
CTAGACCATTCACCACCACAACAG |
ACACA |
ACAGGCACCTTACCACAGATCC |
GGCAGGCAGTAACCATTCATCAC |
PDIA4 |
AGTCTGCCTGTTAGTGCTCCTC |
CACCTTCTTCTTCTTCTTCTCCTTGG |
DERL3 |
CAGCCGCCGCCTCAGTAG |
GACCAAAGCCGTTCTTCAGACAG |
CAPN9 |
GCGTTATAGAAGAGCATCCCAGAG |
GAGCAAGCCAGAATCACAGTCC |
2.1.5. 数据分析
实验数据采用Excel和SPSS 27.0软件进行统计分析，数据采用单因素方差分析，数据值以均数 ± 标准误(mean ± SEM)表示，采用LSD法进行多重检验比较差异显著性，P < 0.05表示差异显著。
3. 结果与分析
3.1. 不同浓度绿原酸对黄喉拟水龟血清及肝脏蛋白和甘油三酯的影响
如表3所示，投喂绿原酸的实验龟血清中的总蛋白除CGA2组显著高于对照组外，其余实验组相比对照组没有显著性差异。CGA2、CGA4两组血清甘油三酯含量显著低于对照组，CGA1、CGA8组血清甘油三酯含量相比对照组没有显著性差异。
Table 3. The effects of chlorogenic acid on serum TP and TG levels in yellow pond turtle
表3. 绿原酸对黄喉拟水龟血清总蛋白及甘油三酯含量的影响
组别 |
Con |
CGA1 |
CGA2 |
CGA4 |
CGA8 |
TP/(g/L) |
1.62 ± 0.22 |
2.51 ± 0.16 |
2.71 ± 0.12 |
2.36 ± 0.45 |
2.49 ± 0.41 |
TG/(mmol/L) |
1.13 ± 0.04a |
1.07 ± 0.07ab |
0.94 ± 0.05bc |
0.84 ± 0.04c |
1.04 ± 0.05ab |
注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P < 0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P > 0.05)，下同。
肝脏总蛋白及甘油三酯含量如表4所示，CGA1、CGA2、CGA8组肝脏总蛋白含量显著高于对照组。甘油三酯含量方面，绿原酸添加组中仅有CGA4组肝脏甘油三酯含量显著低于对照组，其它组甘油三酯含量与对照组相比差异不显著。
Table 4. The effects of chlorogenic acid on liver TP and TG levels in yellow pond turtle
表4. 绿原酸对黄喉拟水龟肝脏总蛋白及甘油三酯的影响
组别 |
Con |
CGA1 |
CGA2 |
CGA4 |
CGA8 |
TP/(g/L) |
4.02 ± 0.11b |
4.57 ± 0.21a |
4.69 ± 0.11a |
4.34 ± 0.14ab |
4.61 ± 0.16a |
TG/(mmol/gprot) |
1.18 ± 0.05a |
1.16 ± 0.03a |
1.07 ± 0.05ab |
0.93 ± 0.06b |
1.17 ± 0.08a |
3.2. 不同浓度绿原酸对黄喉拟水龟肝脏脂质及蛋白合成基因的影响
绿原酸对黄喉拟水龟肝脏蛋白合成基因的影响如图1所示，CGA2组的三个蛋白代谢相关基因PDIA4、DERL3及CAPN9基因表达量均有显著提升，CGA4、CGA8组仅有DERL3基因表达显著提高。CGA1组的3个被测基因，以及CGA4、CGA8组的PDIA4、CAPN9基因表达量与对照组相比均无显著差异。
由图2可见，在饲料中添加绿原酸后，CGA2和CGA4组的黄喉拟水龟AKR1D1基因表达量显著降低。CGA4组的P450基因表达显著降低。所有绿原酸添加组ACACA基因表达量与对照组相比均无显著差异。
4. 讨论
目前，绿原酸对动物血清及肝脏TP含量影响的报道较少。本研究结果表明，在饲料中添加绿原酸后，CGA2组实验龟血清TP含量显著提高，CGA1、CGA2、CGA8组肝脏TP含量相较对照组均有显著提升，表明在饲料中添加绿原酸可提高黄喉拟水龟肝脏合成蛋白质的能力，有利于维持黄喉拟水龟正常的代谢和生理功能。TG含量是鉴定动物脂质代谢能力的关键生化指标，而在本研究中CGA2、CGA4组血清中的甘油三酯含量相较对照组显著下降，CGA4组肝脏中的甘油三酯含量相较对照组显著减少。该结果与以往的报道相似，如马建茸等的研究发现在高脂饲料中添加绿原酸可以显著减少花鲈(Lateolabrax maculatu)血清中TG的含量[12]；扬天俊等[13]的研究显示，在饲料中添加400 mg/kg浓度的绿原酸可以降低草鱼血清及肝脏中的TG含量从而减少肝脏细胞内的脂质沉淀；温安祥等[14]的研究显示绿原酸可以
Figure 1. The effects of chlorogenic acid on the expression of liver protein metabolism-related genes in yellow pond turtle
图1. 绿原酸对黄喉拟水龟肝脏蛋白代谢相关基因表达的影响
Figure 2. The effects of chlorogenic acid on the expression of liver lipid metabolism-related genes in yellow pond turtle
图2. 绿原酸对黄喉拟水龟肝脏脂质代谢相关基因表达的影响
提高中华鳖(Trionyx sinensis)肌肉中胶原蛋白的含量并降低胆固醇的含量。总之，向饲料中添加适量的绿原酸可以提高黄喉拟水龟血清和肝脏的TP并降低TG的含量。
肝脏是水生动物重要的代谢器官，参与蛋白质与脂质的代谢，以往研究表明绿原酸可以上调动物肝脏中脂质代谢基因的表达，如Jin [3]等和Yin [5]等的研究中发现绿原酸可以通过增强SREBP-1c、DGAT2等脂质代谢基因的表达来调控脂质在肝脏中的沉淀水平；马建茸等的研究证实绿原酸主要通过上调肝脏中负责脂质代谢的FATPs和CYP7A1基因来减少肝脏脂质的沉积[12]。在本研究中，CGA4组脂质合成的基因AKR1D1和P450的表达水平均有显著下调，CGA4组血清和肝脏的甘油三酯含量亦显著低于对照组。AKR1D1基因编码蛋白主要作用是催化Delta4-3-氧类甾体5β-还原酶、酮类甾体单氧化酶和甾体脱氢酶，而这三种酶主要参与类固醇的合成；P450基因编码蛋白主要负责催化甾体17-α-单氧化酶，参与类固醇激素的合成，推测绿原酸可能通过下调脂质合成相关的AKR1D1和P450基因来减少肝脏脂质的沉淀。同时在本研究中，CGA2组蛋白合成代谢相关的PDIA4、DERL3及CAPN9基因表达水平均为各实验组中最高值，CGA2组血清与肝脏中总蛋白含量亦为最高。PDIA4基因编码蛋白主要负责激活蛋白质二硫键异构酶，该酶主要负责在内质网中参与蛋白质的折叠，DERL3基因则具有与错误折叠的蛋白质结合并激活泛素特异性蛋白酶使其降解错误折叠蛋白质的功能，CAPN9基因主要编码钙依赖性半胱氨酸型内切肽酶，该酶主要参与蛋白质的切割和降解。因此推测绿原酸可能通过上调肝脏中PDIA4、DERL3及CAPN9基因表达以提高黄喉拟水龟蛋白质合成和降解错误合成的蛋白的能力，但后续仍需深入研究以证实。
5. 结论
绿原酸可提高黄喉拟水龟肝脏合成总蛋白的能力、降低血清和肝脏中的甘油三酯含量，上调PDIA4、DERL3、CAPN9等蛋白代谢相关基因的表达、下调AKR1D1、P450等脂质代谢相关基因的表达。在本研究条件下，绿原酸在黄喉拟水龟饲料中最适添加量为200~400 mg/kg。
基金项目
广西水产技术推广站项目(202300180)。
NOTES
*通讯作者。