1. 前言
簕菜(Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.)，又称苦刺、三加皮、三叶五加、鹅掌簕等，味苦，性微寒，属于五加科(Araliaceae)五加属(Camtho panax)的一种多年生野生蔬菜，广泛分布于我国中部及南部，尤其以广东、广西、海南等地为主[1]。研究表明，簕菜含有的黄酮类、多酚类及挥发油等活性物质，具有清热解毒、凉血止血、舒筋活络等功效，是民间常用的一种药食两用植物，在民间有着悠久的历史和广泛的应用。其中黄酮类化合物有显著的抗氧化、抗炎、抗菌等多种生物活性，能够清除自由基、抑制氧化应激反应、保护细胞免受氧化损伤等，对维护人体健康具有重要意义[2] [3]。
超声波技术是一种利用超声波的空化效应、机械效应和热效应等原理来加速植物活性成分释放的技术。与传统的提取方法相比，超声波辅助提取技术具有提取效率高、提取时间短、能耗低、操作简便等优点[4]。近年来，超声波辅助提取技术在植物活性成分的提取中得到了广泛应用，并取得了显著的研究成果。但现研究关于超声波辅助提取簕菜粉黄酮还相对较少，因此本实验选取超声波辅助提取簕菜粉的总黄酮，在单因素实验的基础上，通过正交试验分析法对总黄酮的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并考察其抗氧活性，以期为簕菜粉的进一步开发利用提供参考[5] [6]。
2. 材料及方法
2.1. 实验材料与仪器
簕菜粉：广东省恩平市响山茶；芦丁分析标准品(98%)：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、无水乙醇：分析纯，西陇科学股份有限公司；氢氧化钠、九水硝酸铝、L-抗坏血酸、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基试剂(DPPH·)：分析纯，麦克林化学试剂有限公司。
FA3204C型电子分析天平；FW-100型高速粉碎机；KQ-500DE型超声波清洗器；V-5000型可见分光光度计；SHZ-D111型循环水式真空泵。
2.2. 实验方法
2.2.1. 芦丁标准曲线绘制
参考唐婷范[7]等人的硫酸铝显色法方法：将108 mg芦丁标准品(98%)溶于80 mL 60%乙醇中，待其温度降到室温后移至100 mL容量瓶，并用60%乙醇定容至100 mL，震荡均匀得到1.08 mg/mL的芦丁标准储备液。取7个50 mL棕色的容量瓶依次加入0.00 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL、2.40 mL的标准储备液，再各加20 mL 30%乙醇和2.0 mL亚硝酸钠，静置5 min后加入2.0 mL硝酸铝溶液，再次静置5 min。随后加入1 mol/L的氢氧化钠溶液20 mL，蒸馏水定容置100 mL，摇匀静置10~15 mi，在500 nm的波长下测定吸光度。
2.2.2. 单因素对簕菜粉提取的影响
设计4个单因素来考察其对簕菜粉黄酮提取得率的影响，四个因素范围选取分别为：提取液乙醇体积分数选择40%、50%、60%、70%、80%；超声波时间选择10 min、20 min、30 min、40 min、50 min；固液比选择1:40、1:60、1:80、1:100、1:120 g/ml；超声波功率选择分别为：300 w、350 w、400 w、450 w、500 w。
2.2.3. 正交试验优化簕菜粉提取工艺
基于单因素试验的结果，采用正交试验法优化簕菜粉中黄酮化合物的最佳提取工艺，并测定最优提取率以及在最优工艺的基础上提取更多的簕菜粉黄酮用于DPPH自由基抗氧化活性的测定。
2.2.4. DPPH自由基清除法测定抗氧化活性
参考谭富耀[8]等人关于DPPH自由基清除法，以抗坏血酸为对照组，将簕菜粉黄酮提取液用蒸馏水分别配制成浓度为0.50 mg/mL、1.00 mg/mL、1.50 mg/mL、2.00 mg/mL的待测液，分别取4.0 mL待测样液和4.0 mL 0.2 mmol/1DPPH·溶液于试管中，充分摇匀，并于室温下避光反应30 min后测定反应样液在517 nm处的吸光度A1；然后用4.0 mL无水乙醇代替DPPH·溶液，测定吸光度A2；此外，以4.0 mL无水乙醇替代待测液，测定空白吸光度A0。DPPH自由基清除率的计算如公式(1)：
(1)
3. 结果与分析
3.1. 芦丁标准曲线
Figure 1. Standard curve of rutin
图1. 芦丁标准曲线
由图1所示，芦丁的质量浓度(mg/mL)和所测定得的吸光度的标准曲线回归方程为Y = 8.371 * X − 0.0005714，相关系数R2 = 0.9996。由此可见，在芦丁标准样品配制的标准溶液在0~0.0508 mg/mL的范围内具有良好的线性关系，可用于测定簕菜粉中黄酮的含量。
3.2. 单因素对簕菜粉黄酮提取的影响
3.2.1. 乙醇浓度对簕菜粉黄酮提取的影响
由图2可知，在乙醇浓度为40%~60%的范围内，簕菜粉黄酮的提取率随着乙醇浓度的增大而提升，并于60%乙醇浓度时达到最大。当乙醇浓度继续增加至60%~80%区间内，簕菜粉黄酮的提取率逐渐下降。出现此现象的原因可能是由于随着乙醇浓度的增大，溶液极性与黄酮极性相近，促进黄酮类物质的溶出，黄酮的得率逐渐增大；但是当乙醇浓度过高时，水含量减小，表面活性剂溶解度下降，降低了簕菜粉与乙醇的接触，导致黄酮得率减少[9]。
注：不同字母表示具有显著性差异(P < 0.05)；图2~5同。
Figure 2. Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Acanthopanax trifoliatus flour
图2. 乙醇浓度对簕菜粉黄酮提取率的影响
3.2.2. 超声时间作为单因素的分析
由图3可知，超声时间在10~40 min区间范围内，随着超声时间的延长，黄酮物质更加充分地被提取剂提取出来，导致提取率不断上升，在40 min时达到最高提取率。但超过40 min后，随着超声提取时间延长，簕菜粉黄酮提取率反而下降，这可能是因超声时间过长随之造成的溶液温度升高，进而可能引发黄酮类化合物内部结构遭到破坏或发生降解，导致提取率下降[10]。
3.2.3. 固液比作为单因素的分析
由图4可知，簕菜粉黄酮的提取率随着固液比的增加呈现出先增后减的趋势。当固液比为1:40时，提取率达到最高，为5.64%。当固液比在1:60~1:20范围内时，提取率开始下降。其原因可能是当固液比为1:60时，黄酮类物质已完全溶出，再增加乙醇溶剂的用量，因溶液中浓度差使得黄酮的损失率提高，从而导致提取率而下降[11]。由此可见，在提取有机物的过程中原料与溶剂的比例也是十分关键的因素。
Figure 3. Effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids from Acanthopanax trifoliatus flour
图3. 超声时间对簕菜粉黄酮提取率的影响
Figure 4. Effect of solid liquid ratio on the extraction rate of flavonoids from Acanthopanax trifoliatus flour
图4. 固液比对簕菜粉黄酮提取率的影响
3.2.4. 超声功率作为单因素的分析
由图5可知，簕菜粉黄酮提取率在超声功率300~450 W范围内呈现上升趋势，而当功率在450~500 W区间内，簕菜粉黄酮提取率随着超声功率增大而降低。其原因可能是超声波在物料内部引发的振动效应。当超声功率在300~450 W时，超声波功率较小对植物细胞和分子间的作用较小，随着超声波功率增大，空化效应更强烈，因此簕菜粉黄酮提取率增大；然而当功率超过450 W时，强烈的超声波功率可能导致黄酮结构受损，从而引起提取率的降低[12]。因此，为获得最高簕菜粉黄酮提取率，需将超声功率控制在450 w左右，以优化簕菜粉黄酮的提取效果。
Figure 5. Effect of ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids from Acanthopanax trifoliatus flour
图5. 超声功率对簕菜粉黄酮提取率的影响
3.3. 正交实验法探究最优提取工艺条件
为探究提取簕菜粉黄酮的最佳工艺条件，以单因素实验所得的最佳条件及其相邻两个条件作为参考作L9(34)正交实验。选择单因素实验中所确定的乙醇浓度(A)、超声时间(B)、固液比(C)、超声功率(D)4个因素，每个因素选择了3个水平，具体如表1所示：
Table 1. Orthogonal experiment level table
表1. 正交实验水平表
水平 |
单因素 |
乙醇浓度(A)/% |
超声时间(B)/min |
固液比(C) |
超声功率(D)/w |
1 |
50 |
30 |
1:40 |
400 |
2 |
60 |
40 |
1:60 |
450 |
3 |
70 |
50 |
1:80 |
500 |
以表中的各个单因素水平，对单因素间互相交错进行实验，共计9组实验，分别进行正交优化试验，并根据标准曲线公式计算黄酮提取率，结果如表2所示：
Table 2. Analysis table of orthogonal experiment
表2. 正交实验分析表
试验号 |
A |
B |
C |
D |
黄酮提取率/% |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3.03 |
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
4.16 |
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
5.29 |
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
4.56 |
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
4.47 |
续表
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
6.19 |
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
5.57 |
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
5.19 |
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
5.41 |
均值1 |
4.160 |
4.387 |
4.803 |
4.303 |
|
均值2 |
5.073 |
4.607 |
4.710 |
5.307 |
|
均值3 |
5.390 |
5.630 |
5.110 |
5.013 |
|
R |
1.230 |
1.243 |
0.400 |
1.004 |
|
根据表2的实验数据分析，各因素对簕菜粉黄酮含量影响的大小顺序为：B (超声时间) > A (乙醇浓度) > D (超声功率) > C (固液比)。通过正交试验优化得到的最佳工艺参数组合为A3B3C3D2，具体为乙醇浓度70%，超声时间50 min，固液比1:80，以及超声功率450 W，提取率效果达到最佳。以最佳实验进行3次平行实验，得到簕菜粉黄酮的提取率为5.65% ± 0.41%
3.4. 抗氧化活性测定
由图6可知，随着抗坏血酸和簕菜粉黄酮样品溶液浓度的增加，其DPPH自由基清除率也随之增大。在相同浓度条件下，尽管簕菜粉黄酮的总还原能力不及维生素C，但簕菜粉黄酮样品溶液的DPPH自由基清除率均保持在80%以上，显示出优异的抗氧化性能[13]。
Figure 6. Comparison of DPPH free radical scavenging rates of ascorbic acid and flavonoid sample
图6. 抗坏血酸与黄酮样品DPPH自由基清除率的比较
4. 结论
本试验采用超声辅助提取簕菜粉黄酮类化合物，并对其抗氧化活性进行探究。基于单因素试验的结果，采用正交设计优化了簕菜粉黄酮提取条件，确定了最佳工艺参数是：乙醇浓度70%，超声时间为50 min，料液比为1:80，超声功率为450 W。在此最优条件下，簕菜粉黄酮的提取效率达到了5.65% ± 0.41%。DPPH自由基清除率抗氧化实验研究表明，簕菜粉黄酮具有良好的抗氧化性能。簕菜作为两广地区特有的一种草本资源，具有非常高的地域独特性，加上其内含的多种活性物质都对生物体有裨益，具有很高的研究价值和应用前景。加强对簕菜的研究，不仅有助于补充我国在相关方面的资料空白，同时对自然资源的开发利用也有着长远的意义。
基金项目
省级大学生创新创业训练计划项目(S202310579002)。
NOTES
*通讯作者。