1. 引言

随着我国细点石斑鱼(Epinephelus cyanopodus)人工繁育取得成功并实现工厂化循环水养殖，生产效率进一步提高，市场需求持续扩大，然而雌雄难辨的问题导致育种工作进展缓慢。传统的育种方法往往耗时长、效率低，难以在早期发育阶段对优质雄性亲本进行筛选。目前苗种生产中雄鱼的获取主要依靠喂食雄激素[1]，自然雄鱼获取困难，基于基因组学的分子标记辅助育种则可通过DNA标记筛选亲本，大大提高育种效率和准确性。近年来，斑马鱼(Danio rerio) [2]、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus) [3]、云纹石斑鱼(Epinephelus moara) [4]、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) [5]、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara) [6]、褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus) [7]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) [8]和东星斑(Plectropomus leopardus) [9]等多种常见养殖鱼类的全基因组图谱已被解析，通过比较基因组学分析，鉴别出诸多与生长、发育、繁殖等重要性状相关的基因和标记，如通过对鞍带石斑鱼的基因组解析获取了其快速生长和免疫的相关基因[3]；斜带石斑鱼基因组揭示了其性别调控受社群因素的影响及其内在的调控机制[5]；半滑舌鳎的比较基因组学分析鉴定出了性别鉴定的关键标记[8]，为伪雄鱼的培育提供了关键技术支持。细点石斑鱼的基因组序列虽已发表[10]，但对应的基因组注释文件(GFF/GTF)尚未公开，基因组学数据的缺失对育种工作造成了一定阻碍。此外，石斑鱼存在性逆转现象，无性染色体，性别决定的关键基因片段难以定位，有学者比较斜带石斑鱼雌鱼和原发性雄鱼、次发性雄鱼全基因组序列的差异，没有发现性分化相关基因的扩增或缺失[5]，表明石斑鱼性别决定的遗传基础可能与非编码的调控序列或环境因素的变化有关。而褪黑素(Melatonin, MT)作为脊椎动物中高度保守的基本功能蛋白，在鱼类性别受环境调控中的作用早有报道[11]。MT合成受光照影响的特点使得通过改变光照来实现性别定向转变成为可能。内源性MT主要在体内的松果体细胞中合成，色氨酸通过羟化酶和脱羧酶作用形成血清素，血清素被芳香烷胺N-乙酰转移酶(AANAT)乙酰化，然后被乙酰色氨酸-O-甲基转移酶(ASMT)甲基化，最终形成MT [12]。因此，定位MT合成通路中包括aanat在内的关键酶编码基因对于明确细点石斑鱼的性别调控原理、促进实际生产的繁育工作有重要意义。本文以基因组注释工作为基础，通过近缘物种的比较基因组学分析，系统全面分析了细点石斑鱼在进化方面的差异，并准确定位到aanat基因所在区域，为进一步利用MT通路调控性别分化提供了理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料

实验用鱼为12月龄细点石斑鱼(体重约800 ± 20 g)，于2024年7月购自天津市兴盛海淡水养殖有限责任公司工厂化循环水养殖车间，在冰盘上进行解剖，分别取心脏、肝、脾、脑、肌肉、头肾六个组织约0.25 ± 0.05 g样品放在无酶管中，并置于液氮中速冻，然后保存在−80℃冰箱中供后续提取RNA。

2.2. 试验方法

2.2.1. 转录组测序与数据质控

转录组测序首先利用真核生物大部分mRNA都带有polyA尾的特征，通过Oligo (dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA。随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断，再进行建库。使用Qubit2.0进行文库定量，稀释文库至1.5 ng/ul，然后在Illumina平台进行测序。利用fastp [13]软件的默认参数进行数据质控，得到clean reads用于后续分析。

2.2.2. 基因组注释

试验所用参考基因组序列(GCA_026686955.1)来自于公开发表的数据集[10]，注释利用同源序列比对、从头预测和转录组比较三种方法进行：一是利用Genewise等软件与赤点石斑鱼Epinephelus akaara (doi.org/10.5061/dryad.4398b9f)、褐点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus (GCF_011397635.1)、斜带石斑鱼Epinephelus coioides (CNA0000026)、云纹石斑鱼Epinephelus moara (CNA0013977)和斑马鱼Danio rerio (GCF_000002035.6) 5个同源物种的编码基因序列进行比对，实现同源预测；二是通过Augustus [14]和GlimmerHMM [15]等软件实现Denovo从头预测；三是通过PASA [16]软件实现转录组预测。最后使用EvidenceModeler [17]将三种方法预测得到的基因集整合为最终结果，并与NR、SwissProt、KEGG和InterPro等蛋白数据库比对实现功能注释。

2.2.3. 比较基因组学分析

比较基因组学分析主要由共线性分析和基因家族分析两部分组成。鉴于目前在生产中赤点石斑鱼的性别调控手段较为明确[1]，且基因组注释数据比较完整，因此选为参考基因组，利用MUMer [18]软件进行共线性比对，使用Syri [19]软件计算基因组上的结构变异信息。利用利用斑马鱼基因组中aanat基因进行blast比对，在比对结果中选择一致性分数最高的片段，在细点石斑鱼的结构变异信息中进行标记。利用Syri软件配套的plotsr模块进行可视化；通过Python脚本(https://github.com/huandna/sv_stat)统计基因组变异中SV和SNP的区域分布，利用R语言ggplot2包进行可视化。基因家族分析部分首先使用OrthoMCL [20]流程进行基因家族聚类，得到单拷贝基因家族及物种特有基因家族，然后选用MUSCLE软件对单拷贝基因进行比对，利用最大似然法(ML)构建物种系统发育树。利用PAML [21]和CAFÉ [22]分别计算分歧时间估计和基因家族扩张和收缩情况，并选取数量显著变化的基因家族进行GO功能富集分析。

3. 结果与分析

3.1. 基因组注释

本文转录组测序质控之后共获取191,439,268条clean reads。通过重复序列注释共得到了3,955,089个转座子重复序列，如表1所示，重复序列总长约490.68 MB，占基因组总长49.13%。

Table 1. Repeat sequence annotation information of genome

表1. 基因组重复序列注释信息

Table 2. Annotated information on the genome structure

表2. 基因组结构注释信息

基因组结构方面，获取了26,743个编码基因序列，具体如表2所示，与同源物种相比，基因数量仅次于斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)，与鞍带石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的基因数量接近。基因平均长度达到18,278 bp，高于比对所用物种，表明注释结果较好，编码基因的数量和完整性都处于较高水平。此外，所有编码基因均在功能数据库中得到注释，其中NR数据库注释到22,791个基因，Swiss-Prot注释到19,962个基因，KEGG数据库注释到19,472个基因，IPRSCAN注释得到24,468个基因，如图1所示，Venn分析结果证明17,973个核心基因在四个数据库中均得到注释。

Figure 1. Gene function annotation statistics

图1. 基因功能注释统计信息

3.2. 共线性分析

试验通过共线性比对揭示了赤点石斑鱼和细点石斑鱼在全基因组层面的差异，并以细点石斑鱼为参考，统计了各类基因变异的数量，如表3所示，比对共发现了1,603,144个单核苷酸变异(SNP)，在基因组变异中占比最高，其次是插入缺失变异(INS, DEL)，分别为200,283和163,454个，数量最少的为倒位(INV)变异。为明确各种基因变异发生的位置，结合注释信息统计了变异在5'非翻译区、5'非翻译区上游2 kb区域、3'非翻译区、3'非翻译区下游1 kb区域、外显子区域、内含子区域和基因间区域的分布情况，结果如图2所示，统计发现单核苷酸变异和结构变异在发生区域上没有显著区别，在基因组序列中，变异出现频率最高的区域为内含子(Intron)区域，其在所有变异相关区域中所占比例分别为46.5%和45.5%。紧随其后的是基因间区域，其占比分别为41.3%和42.3%。相比之下，5′非翻译区上游2 kb区域的变异比例最低，仅占所有区域的0.3%。外显子(Exon)区域，作为成熟mRNA的必要组成部分，其变异比例相对较低，分别为4.6%和3.2%。这种分布现象的成因可归结为两方面：首先，内含子和基因间区域在基因组序列中占据较大的长度比例；其次，这些区域的变异对基因组功能的影响相对较小，因此在近缘物种间得以保留，而成熟mRNA外显子区域中的非同义突变则可能导致编码蛋白的改变，进而影响遗传关系发生根本变化。

Table 3. Statistics of genomic variation types

表3. 基因组变异类型统计

Figure 2. Regional distribution characteristics of genomic variation

图2. 基因组变异区域分布特点

在本次试验中，研究者们特别关注了性别调控机制中，涉及MT合成过程中的一个关键因素，即AANAT酶的编码基因aanat。通过分析，我们发现，无论是在细点石斑鱼还是赤点石斑鱼的基因组中，aanat基因都位于3号染色体上，序列共线性比对结果如图3所示，灰色部分表示正向匹配的区域，橙色部分则表示发生了倒位，绿色表示该DNA片段在进化中出现了易位，黑色部分表示aanat基因，可以看出它在二者的基因组上的相对位置非常接近，这表明在进化过程中，这两个基因的物理位置并没有发生显著的改变。此外，通过对这两个基因序列的对比分析，我们还观察到它们在进化过程中序列的高度保守，这意味着这些基因在不同物种间保持了相对稳定的结构，未发生大片段的结构变异。

3.3. 基因家族分析

基因家族分析结果显示8个物种基因家族共有22,566个，其中单拷贝基因家族共有13个，经过基因家族聚类分析，细点石斑鱼的特有基因家族有133个基因家族类型，包含331个基因，独有的基因家族数量处于中等水平，结果如图4所示。所有物种共有基因家族有49个基因家族类型，包含110个基因，斑马鱼作为亲缘关系最远的对照物种，拥有1021个独有的基因家族，符合试验预期，基因家族聚类过程较为可靠。

本文得到发育进化树之后依据分子钟理论，计算出分歧时间；依据基因家族数量变化，得到基因家族收缩扩张情况，如图5所示，横坐标表示进化时间，进化树中绿色数值为扩张的基因家族数目，红色数值为收缩的基因家族数目，结果表明细点石斑鱼约在1200万年前发生分化，相比其他物种比较晚，

Figure 3. Collinearity comparison between the genomes of Epinephelus cyanopodus and Epinephelus akaara

图3. 细点石斑鱼和赤点石斑鱼基因组共线性比对结果

Figure 4. The distribution of gene family in different species

图4. 不同物种中基因家族分布情况

Figure 5. Gene family contraction or expansion and species divergence time analysis

图5. 基因家族收缩扩张及物种分歧时间分析

Figure 6. GO (Gene Ontology)functional enrichment of gene family expansion (A) and contraction (B)

图6. 基因家族扩张(A)和收缩(B)的GO功能富集分析

与赤点石斑鱼亲缘关系最近。基因家族的扩张收缩情况表明，同它们最近的祖先相比，细点石斑鱼基因组有220个基因家族发生了扩张，228个基因家族发生了收缩。GO功能富集分析的结果如图6所示，横坐标表示富集程度，纵坐标则表示其功能，图中点的大小表示基因家族数量，颜色则代表错误发现率(FDR)，FDR越低其表示可靠性越高。细点石斑鱼收缩的基因家族主要富集在细胞通道活动、离子通道转移酶活性及含硫化合物的转运等功能方面，而扩张的基因家族则主要富集在核酸酶活性、收缩纤维和肌原纤维合成等方面。

4. 讨论

脊椎动物一般只有单一形式的AANAT蛋白，但有研究证明硬骨鱼中存在aanat1a、aanat1b和aanat2三种亚型[23]，可能是在进化中部分鱼类经过了两轮全基因组复制事件(WGD)导致该基因存在多个拷贝，但是目前尚未证明三者有明显的功能差异，只是对应编码的基因片段在鱼体内不同部位分布存在差异，本试验选取了比对一致性最高的aanat2基因作为同源基因进行展示。由于条件限制，试验尚未通过实验验证雌雄细点石斑鱼的基因表达差异，有研究人员发现，在雌性斜带石斑鱼体内植入MT后五周，其性腺完全转变，并出现大量雄性生殖细胞，与自然睾丸相似[24]。表明MT通路在调控石斑魚性别方面仍具有较大的探索空间，下一步可以通过差异光照实验来检测MT通路中各基因表达水平，探索改变光照条件实现性别调控的新方法。此外，基因家族收缩与扩张及功能富集分析的结果表明，在进化过程中，细点石斑鱼的基因组在性别发育方面与近缘鱼类相比未表现出显著变化，证明石斑鱼种群中的性别调控机制相对保守。在离子通道功能方面，基因家族相比近缘物种发生了较大变化，结合已有研究结果可以推测，这可能与海底板块运动、印度–澳大利亚群岛的隆起以及海底火山爆发引起的地理隔离[10]有关。在这种环境变化下，细点石斑鱼发生了适应性进化，尤其是含硫化合物的离子通道功能方面基因变化很可能与海底火山喷发导致的硫化物浓度上升密切相关。

5. 结论

细点石斑鱼作为近年来在天津地区成功养殖的南方鱼类，在实际生产、繁育中有许多需要借鉴其他品种之处。本文通过基因组共线性比对获取了细点石斑鱼的单核苷酸多态性(SNP)、结构变异(SV)等信息，并利用自主编写的Python脚本统计了基因组各类变异的分布，绘制出较为完整的基因组图谱，为比较基因组学分析开辟了新的视角。通过基因家族分析，揭示了基因水平上，细点石斑鱼与其他石斑鱼种在性别发育方面的相似性，提示我们在生产中可充分借鉴赤点石斑鱼、鞍带石斑鱼和斜带石斑鱼的现有方法，避免重复性的研究工作。在性别研究方面，通过同源比对定位了性别调控关键基因aanat。试验的研究结果也为细点石斑鱼基因组在更多领域内的应用提供了可能，例如可通过非编码RNA序列比对，开发用于区分黄鳍石斑鱼、蓝棕石斑鱼等外观易混淆品种的分子标记；通过与鞍带石班鱼快速生长相关基因的比对，为高产育种提供新思路等。

基金项目

天津市农业发展服务中心青年科技创新项目(zxkj202448)，天津市农业发展服务中心青年科技创新项目(zxkj202445)，国家海水鱼产业技术体系(CARS-47-Z01)，天津市农业产学研用“揭榜挂帅”项目(GBTG202301)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献