1. 引言

银耳(Tremella fuciformis)是担子菌门银耳属真菌的子实体[1]。作为传统食用菌，深受广大人民喜爱，具有非常大的医用和食用价值：有润肠、益胃、补气和血、提神和美容等药理作用[2] [3]；银耳含丰富的多糖、蛋白质及矿物质，同时含有所必需的氨基酸[4] [5]。目前市场上流通的银耳以福建古田和四川通江的最为出名，其中古田银耳获得中国地理标志保护产品称号，是食用菌行业中第一个驰名商标[6]。

银耳多糖(Tremella fuciformis polysaccharides)是其子实体中主要的有效成分之一，含量高达65%以上[7]，具有广泛的生物学活性和功能，如抗衰老[8]、抗氧化[9]-[11]、抗肿瘤[12]、抗炎[13] [14]和降低血糖[15]等。银耳多糖以甘露糖作为主链的杂多糖，其单糖组成包括甘露糖、葡萄糖、岩藻糖和葡萄糖醛酸等，采用不同的提取和分离技术所得到的银耳多糖在单糖成分和比例上有所差异，它们的平均分子质量也从几千到几百万不等[16]。

银耳的细胞壁因有蛋白与多糖结合的结构，难以被破坏，利用传统的提取方法如水提取法、酸或者碱浸提法及酶解提取法[17] [18]等并不能充分释放多糖。因此，研究新型的银耳多糖提取方法成为研究的热点。双水相法是一项新兴技术，它具备从天然来源中分离、富集以及对目标化合物进行初步纯化的能力[19]。已广泛的应用于天然产物中总黄酮[20]和多糖[21] [22]的提取。

对古田银耳中多糖的双水相提取研究未见文献报道。在本项研究中，银耳多糖的提取效率被用作衡量标准，利用单因素试验与Box-Behnken设计(BBD)的响应面法(RSM) [23]，使用乙醇/硫酸铵双水相体系进行古田银耳的多糖提取研究。优化超声时间、银耳粉加入量、乙醇的质量分数(ETOH%)和硫酸铵的质量分数((NH₄)₂SO₄%)等参数，以提取银耳多糖，确定最佳工艺参数。此外，通过羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基等的清除率测定银耳多糖抗氧化性能，为银耳多糖的进一步开发利用提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料与仪器

古田银耳：杭州老百姓大药房；对照品葡萄糖、无水乙醇、氢氧化钠；DPPH、硫酸铵水杨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、过氧化氢、苯酚：国药集团化学试剂有限公司；硫酸：永华化学股份有限公司；所有试剂均为分析纯；水为超纯水。

紫外可见光分光光度计752N，上海佑科仪器仪表有限公司；超声波清洗器KQ3200V，昆山市超声仪器有限公司；智能磁力搅拌器ZNCL-GS，巩义市予华仪器有限责任公司；傅里叶红外光谱仪JASCO FTIR-4600，日本分光株式会社。

2.2. 实验方法

2.2.1. 银耳预处理

洗净后银耳入烘箱40℃烘干，冷却后使用多功能粉碎机粉碎，将所得粉过筛(200目)。转移到干燥的试剂瓶中密封存储。

2.2.2. 银耳多糖提取工艺

参考杨子敬等[19]、李金婷等[20]的实验方法：固定体系质量为10 g，将一定质量的无水乙醇、硫酸铵和银耳粉加入到15 mL离心管中。将混合物在涡旋混合器中混合30 s，然后在超声波清洗器中以一定的时间和功率进行超声波处理。再进行7000 r/min离心15 min，离心后，放置直至上、下相体积不变，记录上相体积并收集上清液。

2.2.3. 单因素实验

固定体系质量为10 g，分别考察硫酸铵的质量分数(22%、24%、26%、28%和30%)、乙醇的质量分数(20%、22%、24%、26%及28%)、超声时间(10、20、30、40、50和60 min)和银耳粉加入量(1、3、5、7和9 mg)等各独立参数对银耳多糖提取的影响。

2.2.4. 响应面试验优化试验设计

Table 1. Factors and levels of response surface experiment

表1. 响应面试验因素和水平

在参考了多篇响应面优化实验的文献后[24]-[27]，由单因素的实验结果，最终选硫酸铵的质量分数、乙醇质量分数和银耳粉加入量三个参数作为自变量，以银耳多糖提取含量作为响应值。采用Box-Behnken试验设计了三因素三水平的优化试验。Box-Behnken试验设计的水平编码见表1。

2.2.5. 银耳多糖提取含量的计算

1) 标准曲线的绘制

参考文献[21]采用苯酚–硫酸显色法，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。以葡萄糖的浓度为横轴、吸光度测定值为纵轴，进行标准曲线绘制。得到标准曲线回归方程y = 0.0091C + 0.1244，相关系数R² = 0.997。葡萄糖浓度与吸光度测定值在0.02~0.14 mg/mL的范围内呈良好的线性关系。

2) 银耳多糖提取及计算

按照“2.2.2”的方法提取银耳多糖，取少量离心后的银耳多糖提取液于10 mL试管中，加纯水补至1.0 mL。以下按文献[21]同样操作。用葡萄糖测定的标准曲线计算多糖浓度。再按照下式计算银耳多糖提取含量。

$W=\frac{C\times V}{m}$ (1)

式中：W表示银耳多糖提取含量mg/g；C是根据吸光度计算的溶液浓度(mg/mL)，V是上相溶液的体积(mL)，m是银耳粉的质量(g)。

2.2.6. 多糖红外光谱数据采集

利用傅里叶变换红外光谱仪扫描多糖样品进行光谱采集。取经冷冻干燥的银耳多糖与溴化钾充分研磨，并取适量压片。仪器在室温条件下预热30 min，在400~4000 cm⁻¹波长进行扫描，波长间隔2 nm；扫描次数为32次。

2.2.7. 银耳多糖的抗氧化性

1) 羟基自由基清除率的测定

参考刘宇等[28]人实验方法，配置浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL浓度的银耳多糖溶液，移取1.5 mL样品溶液，依次加1.0 mL浓度为910⁻³ mol/L的FeS0₄溶液，浓度为9 × 10⁻³ mol/L的水杨酸—乙醇溶液1.0 mL和纯水2 mL，随后加1.0 mL浓度为入6 × 10⁻³ mo/L的H₂O₂，于37℃水浴反应0.5 h。于510 nm波长测吸光度。以纯水为空白组。同时以Vc作阳性对照。按等式(2)计算样品的羟基自由基的清除率。

$羟基自由基清除率\text{\%}=\frac{A_O-\left(A_X-A_{OX}\right)}{A_O}\times 100$ (2)

式中，A_o：空白对照测定的吸光度；A_x：加入样液后测定的吸光度；A_ox：不加H₂O₂时测定的吸光度

2) DPPH自由基清除率的测定

在让凤菊等[29]基础上进行改进：称取DPPH6.3 mg加无水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，即制成浓度为0.16 mmol/L的DPPH工作液。配置1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4 mg/mL浓度的银耳多糖溶液。样品、Vc、空白(乙醇)溶液分别与DPPH溶液等体积混合，充分摇匀，暗处反应30 min，分别于517 nm处测吸光度，阳性对照Vc。按等式(3)计算DPPH自由基的清除率。

$\text{DPPH}清除率\%=\left(1-\frac{A-C}{B}\right)\times 100$ (3)

式中：B表示2 mL无水乙醇 + 2 mL DPPH-乙醇溶液的吸光度；A表示2 mL的DPPH-乙醇溶液 + 2 mL样品溶液的吸光度；C表示2 mL样品溶液 + 2 mL无水乙醇的吸光度

3) ABTS⁺自由基清除率的测定

在王杰等[30]人的实验方法修改：7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，等体积混合后充分摇匀，于黑暗处静置12.5 h后使用。用前稀释混合液在734 nm吸光值为0.7 ± 0.02。另配置0.5、0.7、0.9、1.1和1.3 mg/mL浓度样品。吸取样品和ABTS试剂各2 mL，反应6 min，立即在734 nm波长下测定吸光值,记为A；以乙醇作为空白，阳性对照为Vc。按等式(4)计算ABTS⁺自由基的清除率。

${\text{ABTS}}^{+}\left(\text{\%}\right)=\frac{A-B}{A}\times 100$ (4)

式中A为2 mL ABTS溶液与2 mL乙醇混合后的吸光度；B为2 mL ABTS溶液与2 mL样品溶液混合后的吸光度。

2.2.8. 数据处理

所有实验三次重复，计算平均值，实验结果都以平均值 ± 标准差来表示。采用SPSS 22.0软件进行方差分析(ANOVA)，利用Origin 19b进行绘图。Design-Expert 8.0.6软件用于响应面分析。

3. 结果与分析

3.1. 单因素实验的结果分析

3.1.1. 硫酸铵的质量分数对银耳多糖提取含量的影响

图1可看到，硫酸铵的质量分数在20%~26%之间时，多糖提取率呈正相关，而当达到26%时，多糖提取含量达到最高68.97 ± 1.02 mg/g，而后，多糖提取率反而随着硫酸铵质量分数的增加而降低。分析其原因，最初硫酸铵的质量增加可以促进双水相的形成，从而提高多糖的提取效率。然而，当硫酸铵的质量分数过高时，会导致共沉淀现象增多，进而降低盐相中多糖的含量[31]。基于此，确定硫酸铵的质量分数为26%是最优的提取条件。

注：不同小写字母表示提取含量差异显著，P < 0.05，下同。

Figure 1. Effect of the mass fraction of ammonium sulphate on polysaccharide extraction

图1. 硫酸铵质量分数对多糖提取含量的影响

3.1.2. 乙醇质量分数对银耳多糖提取含量的影响

不同乙醇质量分数对银耳多糖提取含量的影响见图2表示。当乙醇质量分数为24%，是一个分界点，在乙醇质量分数小于24%时，随着乙醇质量分数的增加，银耳多糖的提取率逐渐提高；但是，一旦乙醇质量分数超过24%，继续增加乙醇质量分数会导致银耳多糖的提取量减少。因此，确定乙醇质量分数为24%时，银耳多糖的提取效果最佳。此时多糖提取含量为68.97 ± 1.02 mg/g。在银耳样品中存在脂溶性杂质的情况下，需要合适的乙醇来溶解多糖类化合物。而较高浓度的乙醇会导致硫酸铵盐和多糖发生沉淀。

Figure 2. Effect of the mass fraction of ethanol on polysaccharide extraction

图2. 乙醇质量分数对多糖提取含量的影响

3.1.3. 超声时间对银耳多糖提取含量的影响

Figure 3. Effect of ultrasound time on polysaccharide extraction

图3. 超声时间数对多糖提取含量的影响

图3表示超声时间对银耳多糖提取的影响。随着超声时间的增加，多糖的提取含量增加，在提取时间为30 min时，提取含量得到最大值。超声是进行细胞破碎的过程，因此在适当的超声时间内有利于多糖的提取。而较长的超声时间导致加热，这导致了一些多糖类化合物的降解。但从图看出，在20、30和40 min这三个超声时间内银耳多糖提取含量差异不大，故后续响应面优化不考虑超声时间的优化，选定30 min为提取时间。

3.1.4. 银耳粉加入量对银耳多糖提取含量的影响

银耳粉的加入量多少对银耳多糖提取含量的影响见图4。随着银耳粉量的增加，细胞内外浓度差增加，多糖的扩散力增加，多糖的提取含量也随之增加，在银耳粉加入量到5 mg时，银耳多糖含量为最大量，但当银耳的量 > 5 mg时，溶质与溶剂的接触面浓度差减小，多糖扩散力降低，萃取液中多糖类化合物已饱和，这导致提取率降低。

Figure 4. Effect of Tremella fuciformis powder addition on polysaccharide extraction

图4. 银耳粉加入量对多糖提取含量的影响

3.2. 响应面法优化试验提取条件结果

3.2.1. 模型的建立与显著性检验

采用Box-Behnken响应面法对超声辅助双水相提取银耳多糖进行建模，以硫酸铵质量分数(A)、乙醇质量分数(B)和银耳粉加入量(C)为自变量，银耳多糖提取含量(Y)为响应值，进行三因素三水平试验设计，实验方案和结果见表2所示。采用Design-Expert 8.0软件对表2的数据进行的多元回归分析，结果如表3所示。

银耳多糖提取含量与三个因素间的回归方程为：

Y = 68.1 + 0.83A + 2.00B + 6.83C + 1.31AB − 2.52AC + 1.54BC + 0.64A² − 5.54B² − 8.10C²

对上述二次回归模型的方差分析结果见表3。从表3可得，模型的P值 < 0.0001，F值为64.58，而失拟项的P = 0.7868 > 0.0.05为不显著。说明模型高度显著，模型结果与实验结果拟合度高。表3还得到模型的确定系数R² = 0.9450 > 0.9，表明模型的理论值与实际值有一定相关性；而模型的调整系数 $R_{{}_{Adj}}^2$ = 0.9728，表明97.28%的响应值变化可以使用模型来解释。根据回归方程和方差分析得到各因素对银耳多糖提取含量的影响大小依次为：C > B > A，即银耳粉加入量 > 乙醇质量分数 > 硫酸铵质量分数。

Table 2. Design and results of response surface analysis

表2. 响应面分析设计及结果

Table 3. Analysis of variance of regression model for response surface experiment

表3. 响应面实验回归模型方差分析

注：^*表示差异显著(P < 0.05)；^**表示差异极显著(P < 0.01)。

3.2.2. 响应曲面分析因素交互作用

因素A、B、C之间两两交互作用的等高线图和响应面图见图5。当等高线图趋向于椭圆形状，且响应曲面的曲线变得更加陡峭时，表明两个变量之间的相互作用对银耳多糖提取量的影响更加明显。相反，如果这些特征不明显，则影响较小。根据图表分析，硫酸铵的质量比例与银耳粉的添加量之间的等高线紧密且略微呈椭圆形，响应曲面的斜率较大，这显示出这两个因素的交互作用对提取过程有显著的影响；但硫酸铵质量分数与乙醇质量分数和乙醇质量分数与银耳粉加入量这两对因素的等高线较稀疏，响应曲面坡度较平缓，故这两对因素的交互作用是不显著，这与表3方差分析结果P_AB (0.0710 > 0.05)，P_AC (0.0046 < 0.01)和P_BC (0.0402 < 0.05)具有一致性。

Figure 5. Response surface and contour analysis diagram

图5. 响应面与等高线分析图

3.2.3. 银耳多糖最佳工艺参数及模型验证

经过Design-Expert 8.0的优化，得到采用超声辅助双水相(硫酸铵–乙醇)提取银耳多糖的最佳工艺参数为：硫酸铵质量分数为28%，乙醇质量分数为24.68%，银耳粉加入量为5.60 mg，超声时间为30 min，理论银耳多糖提取含量为70.77 mg/g，为了验证预测值的准确性，同时兼顾操作的方便性，调整最佳工艺条件为：硫酸铵的质量分数28%，乙醇的质量分数25%，银耳粉加入量为6 mg，超声时间为30 min，在此工艺条件下进行验证实验，重复试验3次，得到最后银耳多糖平均提取含量为70.43 ± 0.3，验证了模型预测结果与实验数据之间的高度一致性，这证实了该模型在银耳多糖提取过程中的有效性和适用性。

3.3. 银耳多糖的红外光谱分析结果

从图6的红外光谱结果所示，提取得到的银耳多糖具有多糖的特征吸收，如在3376.65 cm⁻¹的O-H强伸缩振动峰，峰形强且宽，表明有分子间氢键；在2900 cm⁻¹的有亚甲基的弱C-H伸缩振动峰，此为糖类的特征吸收峰。1300 cm⁻¹左右为C-H的变角振动，这也是是糖类的特征吸收峰。1000 cm⁻¹左右强的吸收峰证明为D-吡喃环存在的C-O、C-C伸缩振动峰。

Figure 6. Infrared spectrak of Tremella fuciformis polysaccharide

图6. 银耳多糖傅立叶红外图谱

3.4. 银耳多糖的抗氧化性

3.4.1. 羟基自由基清除率

如图7展示的，银耳粉通过超声辅助的双水相提取法得到的多糖显示出对羟基自由基的清除效果。在0.5~3.0 mg/mL的银耳多糖浓度范围内，随着多糖浓度的逐步提升，其对羟基自由基的清除效果随之增强，直至浓度增至2.5 mg/mL时达到峰值，此后即使继续提高浓度，清除效果也无明显变化。与此同时，维生素C对超氧阴离子自由基的清除效果始终保持在较高水平。实验结果表明，采用超声辅助双水相(硫酸铵–乙醇)提取的银耳多糖具有清除羟自由基的能力，但在相同浓度条件下，清除率低于Vc。对0.5~2.5 mg/mL的银耳多糖浓度的羟基自由基清除率进行线性拟合，具有良好量效关系：y = 0.1634x + 0.6037，R² = 0.9628，由线性曲线计算得银耳多糖羟基自由基清除率的IC₅₀值为0.23 mg/mL。说明银耳多糖具有良好的羟基自由基清除率。

Figure 7. Hydroxyl radical scavenging ability

图7. 羟基自由基的清除能力

3.4.2. DPPH自由基清除率的测定

Figure 8. DPPH free radical scavenging ability

图8. DPPH自由基的清除作用

图8展示了在相同浓度条件下，Vc和通过超声辅助双水相提取的银耳粉多糖对DPPH自由基清除效果的比较结果。随着多糖浓度的增加，其对DPPH自由基清除能力先增加，在多糖浓度达3.5 mg/mL后基本不变，而Vc对DPPH自由基的清除能力始终较高。结果表明，银耳多糖清除DPPH自由基能力不错，但在相同浓度条件下，清除率低于Vc。其DPPH自由基清除率进行线性拟合，具有良好量效关系：y = 0.808x − 0.027，R² = 0.977，由线性曲线计算得银耳多糖DPPH自由基清除率的IC₅₀值为4.49 mg。

3.4.3. ABTS⁺自由基清除率的测定

图9可以看出，Vc和银耳粉超声辅助双水相提取的多糖对ABTS⁺自由基的清除能力与质量浓度成正相关。银耳多糖对ABTS⁺自由基的清除能力始终低于Vc。将银耳多糖对ABTS⁺自由基清除率进行线性拟合，具有良好量效关系：y = 0.7365x + 0.5677，R² = 0.9831，由线性曲线计算得银耳多糖ABTS⁺自由基清除率的IC₅₀值为0.81 mg/mL。由此可知，银耳多糖具有不错的ABTS⁺自由基清除率。

Figure 9. ABTS⁺ free radical scavenging ability

图9. ABTS⁺自由基的清除能力

4. 结论

本研究以福建古田银耳为原料，采用乙醇/(NH₄)₂SO₄双水相体系提取，在超声辅助两水相提取中，利用响应面优化萃取参数。响应面分析法比传统的正交设计试验更准确地反映了各参数之间的交互作用，结果显示：当(NH₄)₂SO₄质量分数、乙醇质量分数、超声时间、银耳粉质量分别为28%、24.68 %、30 min 和5.6 mg时，可获得的银耳多糖提取含量为70.77 mg/g，该提取工艺条件合理可行，可为多糖提取工业化提供良好的指导。对提取的银耳多糖进行红外光谱检测显示：本研究中双水相提取所得银耳多糖在3376.65 cm⁻¹、2900 cm⁻¹、1300 cm⁻¹处有明显吸收，是糖类的特征吸收峰。1000 cm⁻¹左右强的吸收峰证明为D-吡喃环存在的C-O、C-C伸缩振动峰，说明该方法所得银耳多糖具有典型的多糖化合物的结构特征。对提取的银耳多糖的体外抗氧化实验证实，经由双水相途径制备所得银耳多糖对羟基自由基、DPPH自由基和ABTS⁺自由基都有不错的清除率，其清除率IC₅₀分别为0.23、4.49、0.81 mg/mL，可见，银耳多糖具备成为一类天然抗氧化剂的潜力，在食品和健康补充品行业中具有广泛的应用潜力，可认为是具有显著研究和开发前景。这些结果为进一步开发银耳多糖相关产品及研究银耳多糖药理功能提供了理论参考。

基金项目

2023年国家级大学生创新创业训练计划项目(202311842009X)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献