1. 介绍

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌(Breast cancer)的发病率排在第一位[1]。新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy, NAC)能够降期保乳，并允许手术降低局部晚期BC患者肿瘤恶性程度[2]。手术前进行NAC以减小肿瘤负荷并评估BC对治疗的敏感性[3]，新辅助治疗后达到病理完全缓解(pCR)的患者无事件生存率明显优于残留病灶(RD)的患者[4]。临床上术前NAC疗效评估主要是通过乳腺磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、乳腺X线检查、超声(ultrasonography, US)和PET/CT检查等间接评价[5]。但传统的影像学方法对NAC反应的评估具有局限性。Andrea Nicolini研究表明，细胞因子，主要是白细胞介素-12 和干扰素，直接和/或通过与抗雌激素协同作用表现出抗肿瘤作用。它们已被单独用于晚期乳腺癌，或与其他免疫调节因子或药物联合用于免疫学治疗方法[6]。但目前很少有研究表明IL-12和IFN-γ是否可以作为生物标志物，用于乳腺癌新辅助化疗疗效评估。IL-12被认为是一种有效的抗癌剂。IL12能够激活自然杀伤(NK)细胞和T细胞，诱导干扰素γ (IFN-γ)产生。IFN-γ在细胞免疫的激活和随后的抗肿瘤免疫反应刺激中起关键作用[7]。因此本研究通过生信分析与临床相结合的方式来探讨血清IL-12和IFN-γ与乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性，从而为NAC治疗提供更为精准的个体化支持。

2. 材料与方法

2.1. 数据准备与预处理

GSE163882的原始数据从基因综合表达(GEO)数据库(https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo/)下载[8]。该数据集包含222例接受NAC治疗的BC患者，HER2阴性患者159例，HER2阳性患者63例。应用R软件的limma包比较pCR和RD患者的相关差异表达基因(DEGs)，GSE123845为本研究中的独立外部测试集。

2.2. 标本采集与分析

2.2.1. 一般资料

经青岛大学附属医院伦理委员会知情同意并批准，病人均对研究知情同意。研究对象为青岛大学附属医院于2022年3月至2024年4月收治的50名接受新辅助化疗的女性乳腺癌患者，年龄26~75岁，平均年龄(49.1 ± 12.4)岁。

病例纳入标准：1) 经空心针穿刺活检病理诊断为乳腺癌；2) 于我院完整接受4~8周期标准新辅助化疗；3) 临床病理资料完整；4) TNM分期为II-III期。排除标准：1) 合并第二肿瘤；2) 患有血液系统、免疫系统及感染性相关疾病；3) 新辅助化疗前接受任何形式的抗肿瘤治疗。

2.2.2. 病理指标

采用免疫组化评价ER、PR、HER2、Ki67的表达状态。将ER阳性和PR阳性均定义为肿瘤细胞核染色 ≥ 1% [9]；HER2阳性定义为免疫组化染色+++或免疫荧光原位杂交(florescent in situ hybridization, FISH)检测阳性；Ki67阳性判断标准以高倍镜下计数1000个细胞，阳性细胞计数 < 30%为低表达，≥ 30%为高表达；腋窝淋巴结转移定义为化疗前空心针穿刺示腋窝淋巴结内见癌转移。

2.2.3. 血清IL-12及IFN-γ检测

细胞因子测定 NAC治疗前7天内，采取患者空腹状态下静脉血样3~5 ml，4小时内离心分离血清，应用RaiseCyte2L6C流式细胞仪，通过多重微球流式免疫荧光发光法测定患者血清IL-12及IFN-γ含量，试剂盒来源于青岛瑞思凯尔生物科技有限公司。

2.2.4. NAC疗效评价

参照Miller-Payne分级标准：1级浸润癌细胞基本无改变，肿瘤细胞数量总体上未减少；2级浸润癌细胞轻度减少，减少 ≤ 30%；3级浸润癌细胞减少30%~90%；4级癌细胞显著减少 > 90%；5级原肿瘤瘤床部位未见癌细胞浸润，但可存在导管原位癌。及RCB (residual cancer burden)评估系统：RCB0即pCR，表示浸润病灶已达到完全缓解；RCBⅠ浸润病灶少量残留，部分缓解；RCBⅡ浸润病灶中度残留，部分缓解；RCBⅢ广泛病灶残留。本研究将pCR定义为乳腺原发灶无浸润性癌(可存在导管原位癌)且无腋窝淋巴结转移，即原发灶MP5级和RCB分级0级。

2.3. 免疫浸润分析

我们使用GSEABase和GSVA [10]包的单样本基因集富集分析(ssGSEA)鉴别GSE163882数据集中pCR和RD患者28种免疫细胞的丰度。

2.4. 基因富集分析

采用R软件clusterProfiler包进行基因本体(GO)功能注释分析以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析，发现了DEGs的功能作用，P < 0.05，错误发现率(FDR) < 0.05认为有统计学意义。

2.5. 统计学分析

采用R (4.3.1版)和SPSS 25.0软件进行统计分析。采用Spearman方法比较IL12B和IFNG的相关性。采用Wilcoxon检验分析细胞因子与NAC疗效的相关性。采用卡方检验分析临床病理指标与pCR的相关性；ROC曲线图分析法确定IL-12及IFN-γ对NAC疗效预测的最佳截断值；多因素分析采用二元Logistic回归。P < 0.05为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. IL12B和IFNG表达分析

利用GEO数据库GSE163882数据集中的基因表达谱和临床信息对病理完全缓解(pCR)患者和残留病灶(RD)患者进行Wilcoxon秩和检验。pCR患者中IL12B和IFNG表达均高于RD患者，见图1、图2。我们研究了IL12B和IFNG基因的Spearman相关性，发现二者呈正相关(R = 0.70, P = 2.62e−159)，见图3。通过GSE123845数据集作为外部验证，见图4，图5。

Figure 1. Comparison of IL12B expression between pCR and RD tissues

图1. pCR与RD中IL12B表达的比较

Figure 2. Comparison of IFNG expression between pCR and RD tissues

图2. pCR与RD中IFNG表达的比较

Figure 3. Association between IL12B and IFNG expression

图3. IL12B与IFNG表达的关系

Figure 4. Comparison of IL12B expression between pCR and RD tissues

图4. pCR与RD中IL12B表达的比较

Figure 5. Comparison of IFNG expression between pCR and RD tissues

图5. pCR与RD中IFNG表达的比较

3.2. 临床数据分析

本研究共纳入50例研究对象，新辅助治疗后病理评估达到pCR者14例(28.0%)，非pCR者36例(72.0%)。

3.2.1. 血清IL-12、IFN-γ水平与新辅助化疗疗效的相关性

pCR者化疗前血清IL-12水平明显高于非pCR者，差异具有统计学意义(W = 167.5, P = 0.001)；pCR者化疗前血清IFN-γ水平显著高于非pCR者，差异具有统计学意义(W = 694.5, P = 0.001)，表1。

Table 1. Relationship between serum IL-12, IFN-γ levels and adjuvant chemotherapy for breast cancer

表1. 血清IL-12、IFN-γ水平与乳腺癌新辅助化疗疗效的关系

3.2.2. 血清IL-12、IFN-γ预测乳腺癌新辅助化疗疗效

血清IL-12与新辅助化疗疗效的ROC曲线下面积为0.842，血清IL-12的最佳截断值为0.955，此时其预测pCR的灵敏度为0.571，特异度为0.889，见图6；血清IFN-γ与新辅助化疗疗效的ROC曲线下面积为0.943，血清IFN-γ的最佳截断值为2.895，此时其预测pCR的灵敏度为0.786，特异度为0.944，见图7。根据其最佳截断值将患者分为高表达组和低表达组。

Figure 6. ROC curve of serum IL-12 level predicting pCR in breast cancer before chemotherapy

图6. 化疗前乳腺癌血清IL-12水平预测pCR的ROC曲线

Figure 7. ROC curve of serum IFN-γ level predicting pCR in breast cancer before chemotherapy

图7. 化疗前乳腺癌血清IFN-γ水平预测pCR的ROC曲线

3.2.3. 临床病理特征与乳腺癌NAC疗效的关系

单因素结果分析显示，NAC后pCR与腋窝淋巴结转移，PR表达、Her-2表达及血清IL-12、IFN-γ表达显著相关(P < 0.05)，见表2。

Table 2. Relationship between clinicopathological features and NAC efficacy in breast cancer [Case (%)]

表2. 临床病理特征与乳腺癌NAC疗效的关系[例(%)]

3.2.4. 影响乳腺癌患者NAC疗效的多因素分析

将乳腺癌患者NAC疗效设置为因变量，将血清IL-12及IFN-γ表达水平设置为自变量，纳入二元Logistic回归分析，结果示：IFN-γ高表达为乳腺癌患者NAC疗效的保护因素(P < 0.05)，见表3。

Table 3. Multivariate Logistic regression analysis on the effect of NAC in breast cancer patients

表3. 影响乳腺癌患者NAC疗效的多因素Logistic回归分析

3.3. 免疫浸润比较

为了更好地了解免疫功能的差异，我们将IL12B及IFNG差异基因进行了ssGSEA。在检查的28种免疫细胞类型中，与RD患者相比，15种免疫细胞类型在pCR患者中表现出高浸润，包括活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞、活化B细胞和自然杀伤细胞等，见图8。

Figure 8. A boxplot of the immune cell infiltration levels in RD and pCR patients

图8. RD和pCR患者免疫细胞浸润水平的箱线图

3.4. 功能分析

采用GO和KEGG功能富集分析，探讨IL12B及IFNG 差异基因潜在生物学功能及信号通路。GO分析结果显示：在生物过程水平，差异基因在：1) 细胞杀伤功能；2) 淋巴细胞介导免疫；3) 趋化因子介导的信号通路；4) 单核细胞分化；5) 自然杀伤细胞介导免疫方面显著富集，见图9。KEGG通路分析结果表明，差异基因主要参与细胞因子与细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、IL17信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性相关通路，见图10。

Figure 9. GO enrichment analysis of IL12B and IFNG differential genes

图9. IL12B及IFNG差异基因的GO富集分析

Figure 10. A Histogram of the top 10 KEGG signaling pathways

图10. 前10个KEGG信号通路的柱状图

4. 讨论

乳腺癌患者人数在逐年递增。近年来免疫治疗在乳腺癌治疗领域迈进了一大步，肿瘤微环境是癌细胞重要生存环境，更是免疫治疗的重要研究方向[11]。细胞因子是肿瘤微环境中对肿瘤细胞和免疫细胞均有影响的重要组成成分。

人白细胞介素12 (IL-12)是一种由树突状细胞和活化的吞噬细胞产生的促炎细胞因子[12]。作为一种异二聚体细胞因子，可增强辅助性T细胞1 (Th1)的分化并促进T细胞介导的癌细胞细胞溶解[13]，以及抑制肿瘤血管生成。JAK2和JAK1或TYK2介导IL-12细胞因子受体家族相关STAT的磷酸化[14]。IL12能够激活自然杀伤(NK)细胞和T细胞，诱导干扰素γ (IFN-γ)产生[15]。反过来，IFN-γ可以直接杀死肿瘤细胞，抑制血管生成，刺激NK细胞、CTL和巨噬细胞，同时上调肿瘤细胞表面的MHC I和II分子[16]。在临床研究中，IL-12已被评估为多种恶性肿瘤的实验性治疗方法。IL-12还被证明能够诱导T细胞淋巴瘤、艾滋病相关卡波西肉瘤和非霍奇金淋巴瘤的高效抗肿瘤反应[6]。

干扰素-γ (IFN-γ)是由IFNG基因编码的蛋白质，是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调控作用的多效性细胞因子[17]，能够抑制正常细胞和转化细胞的增殖。IFN-γ还可增强抗原呈递，提高肿瘤细胞对CTL (细胞毒性T淋巴细胞)和NK细胞的易感性直接杀伤肿瘤细胞。重组IFN-γ (如Actimmune)已用于治疗某些疾病，如慢性肉芽肿病(CGD)和恶性骨质疏松症[18]。

本文通过GEO数据库的分析，首先发现了IL12B和IFNG在pCR患者中高表达。然后，通过临床数据验证血清IL-12及IFN-γ在pCR患者中高表达有明显统计学意义，数据提示IL-12、IFN-γ可能作为乳腺癌新辅助化疗疗效评估的潜在生物标记。随后通过ssGSEA免疫浸润分析显示活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞、活化B细胞和自然杀伤细胞在pCR患者中高度浸润。IL-12、IFN-γ在乳腺癌NAC疗效评价方面资料较少，准确评估对NAC的反应是影响治疗决策的关键因素[19]。本次研究数据提示血清IL-12及IFN-γ水平的升高可能反映了机体对化疗药物的良好反应及肿瘤细胞的免疫清除作用。

综上所述，血清IL-12及IFN-γ水平在乳腺癌新辅助化疗疗效评估中具有重要的预测价值。未来研究可进一步探讨这些免疫因子在肿瘤免疫微环境中的作用机制，以及联合其他生物标志物提高乳腺癌化疗疗效评估的准确性。

5. 研究的局限性

研究包括样本量小，未随访患者生存情况，无法进行生存分析，未涉及NAC前后细胞因子表达变化。随着样本量的扩大，课题组将不断完善与手术相关的各项指标，并不断扩大随访内容，延长随访时间。期望IL12及IFNγ对乳腺癌患者新辅助疗效的评估等做出更客观的评价。

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。

参考文献