1. 引言

众多研究显示，Janus激酶3 (JAK3)与多种人类疾病的发病机制和进程紧密相连，使得JAK3成为具有高度潜力的药物靶标。作为负责传递超过50种细胞因子信号的关键蛋白家族成员，Janus激酶在免疫应答中发挥着至关重要的作用，成为治疗自身免疫性疾病的有力靶点[1]。然而，目前市场上的JAK抑制剂在阻断细胞因子信号传导过程中缺乏特异性，进而导致了一系列不良反应[2]。因此，下一代抑制剂的研发需在保持疗效的同时最大限度地减少副作用的发生。在JAK家族中，JAK3作为仅针对γc细胞因子的窄谱成员，展现出成为理想靶点的巨大潜力。Janus激酶家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2 (酪氨酸激酶2)四种亚型，它们通过JAK/STAT途径传递信号。其中JAK1、JAK2和TYK2表达广泛，而JAK3主要在淋巴组织表达，作为淋巴细胞发育的关键调控因子，在免疫系统中扮演着核心角色。JAK3与一种特定的细胞因子受体亚基(共同γ亚基或γc链)具有高度特异性的结合能力[3]。

随着人们对于JAK家族相关的研究深入，各种不同的抑制剂被开发出来，其中值得关注的是，一些综述虽然已经详细地总结相关抑制剂开发的研究进展，然而随着计算机技术的不断发展，计算机辅助药物设计技术正在被应用在相关的开发工作中，因此本文更换角度，从计算机辅助设计的角度阐述JAK3抑制剂的相关开发工作。

在本篇综述中，工作重心在于讲述使用计算机辅助药物设计的不同方法结合实验等相关方法，旨在阐述计算机辅助药物技术应用在JAK抑制剂的前沿进展。综述了一些传统的使用简单的分子对接，再到结合分子动力学模拟技术，以及机器学习，深度学习方法等。最后，我们将给出结论和展望。

2. JAK激酶蛋白结构

JAK3的蛋白结构由七个区域组成：FERM域、SH2域、激酶连接区、JH1域、JH2域、JH3域和JH4域。其中，JH1域是JAK3的催化活性域，JH2域是JAK3的假激酶域，它可以调节JH1域的活性。JH3域和JH4域是JAK3的C末端区域，它们可以参与JAK3的蛋白质降解。FERM域、SH2域和激酶连接区是JAK3的N末端区域，它们可以与细胞因子受体亚基γc链结合，从而激活JAK3的信号传导。JAK3的蛋白结构决定了它的功能和调控机制，也为JAK3的药物设计提供了依据。目前，已经有一些JAK3的抑制剂被开发出来，它们主要是通过与JH1域的ATP结合位点竞争，从而阻断JAK3的催化活性[4]。这些抑制剂有一定的选择性，可以减少对其他JAK家族成员的影响，从而降低一些不良反应的风险。然而，这些抑制剂仍然存在一些局限性，比如耐药性、毒性和药代动力学等。因此，还需要进一步探索JAK3的其他结构域，比如JH2域、FERM域和SH2域，以寻找更有效和安全的JAK3的药物靶点(如图1) [5]。

Figure 1. The JAK family comprises four main members: JAK1, JAK2, JAK3, and TYK2. Each kinase consists of seven homology domains (JH1-7), with JH1 being the kinase domain, JH2 the pseudokinase domain, parts of JH3 and JH4 forming the SH2 domain, and JH5, JH6, and part of JH4 making up the FERM domain. The conserved tyrosine phosphorylation sites are Y1038/Y1039 in JAK1, Y1007/Y1008 in JAK2, Y980/Y981 in JAK3, and Y1054/Y1055 in TYK2. Figure b illustrates the structure of JAKs and the sites targeted by JAK inhibitors

图1. JAK家族主要包括四个成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。每个激酶由七个同源结构域(JH1-7)组成，其中JH1是激酶结构域，JH2是伪激酶结构域，JH3和JH4的部分构成SH2结构域，而JH5、JH6和JH4的部分组成FERM结构域。保守的酪氨酸磷酸化位点分别是JAK1的Y1038/Y1039，JAK2的Y1007/Y1008，JAK3的Y980/Y981，以及TYK2的Y1054/Y1055。图b展示了JAK的结构及JAK抑制剂的靶向位点

3. CADD在JAK抑制剂筛选中的研究进展

3.1. 一些临床的JAK抑制剂

Figure 2. Clinical JAK inhibitors and the classification of JAK inhibitors

图2. 临床JAK抑制剂及JAK抑制剂的分类

通过抑制JAK-STAT信号通路并介导诸如类风湿性关节炎、银屑病和特应性皮炎的疾病，成为研究者关注的热点。近年来随着人们对JAK通路的理解，针对其相关的抑制剂不断被发现并应用于临床应用中(如图2)。例如，用于治疗成人中重度特应性皮炎的JAK1选择性抑制剂阿布罗昔尼布[6]。可能减少对其他JAK家族成员的副作用，且在治疗中重度斑块状银屑病方面具有口服活性的酪氨酸激酶2的选择性抑制剂[7]德乌克拉维替尼。又比如减少了非靶点效应的选择性JAK2抑制费德拉替尼。它没有列出任何禁忌症。在治疗骨髓增生性肿瘤，如骨髓纤维化方面有效。乌帕替尼在临床上用于治疗各种炎症性疾病[8]，包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、特应性皮炎、强直性脊柱炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎。鲁索利替尼没有列出任何禁忌症。它在治疗骨髓纤维化和真性红细胞增多症方面有效。该药物在儿童和成人群体中的呕吐潜力低，副作用最小。

3.2. 结构的预测和构建

Figure 3. Figure A depicts the simplified domain structure of TYK2, delineating the pseudokinase-kinase construct boundaries. Figures B and C offer distinct views of the pseudokinase and kinase complex, respectively. Figure B shows the N and C termini of the construct and the kinase inhibitor at the active site. Figure C illustrates the linker region between the pseudokinase and kinase, with simplified diagrams below for reference

图3. 图A展示了TYK2的简化结构域，标明了本研究中使用的伪激酶-激酶构建的边界。图B和图C分别展示了伪激酶和激酶复合体的两个不同视角图。图B揭示了结晶构建体的N端和C端，以及在活性位点的激酶抑制剂分子位置。图C显示了伪激酶与激酶之间的连接区域

尽管一些临床以及正在研究的JAK抑制剂进展良好，但是由于传统的盲筛耗时长，成本高等问题以及生物化学信息化技术发展，驱使着研究者们开始逐渐使用虚拟筛选辅助的方法寻找新的JAK抑制剂，而这一工作的开始是从寻找并了解靶点的结构的相关信息开始的，通过核磁共振，X单晶衍射、冷冻电镜等方法解析靶点蛋白的结构，并在PDB等相关网站上搜寻并使用，对于一些结构信息缺失或序列信息不完整的情况下，使用同源建模和人工智能是目前常用的有效方法同源建模是以实验获得的同源受体三维结构信息为模板，构建目标序列三维结构的方法(如图3)。在JAK抑制剂的早期研究中由于其结构尚未解析，因此药物科学家们常常使用同源建模的方式进行JAK靶点蛋白与潜在药物小分子的分析。随着近些年来人工智能技术的飞速发展使得预测蛋白的技术步入了一个新的台阶[9] Wan-Wan Lin等人通过ColabFold [10]以及算法的校正成功预测了JAK2结构准确率在90%以上，随后Ram W. Sabnis等人在对JAK靶点相关研究时使用AlphaFold [11]，整合多序列比对和特征信息的新架构，并结合注意力机制，不仅解决了蛋白质折叠问题，也显著提高了预测精度，成功预测出超过2亿个蛋白质结构。

JAK家族中最早被解析出的蛋白结构是JAK3的激酶结构域。这个结构于2005年8月1日发表，通过使用X射线晶体学技术获得了JAK家族成员TYK2在自抑制形式下的两个结构域——伪激酶和激酶模块的2.8-Å结构，同时发现了伪激酶和激酶在活性位点附近相互作用并且大多数与癌症相关的JAK等位基因突变都聚集在这个界面或其附近[12]。突变TYK2界面附近与癌症相关的JAK等位基因中的残基相似的位置，包括V617F和“外显子12”JAK2突变，导致体外激酶活性增加。这些数据表明，JAK伪激酶是自抑制结构域，它们保持激酶结构域处于非活跃状态，直到受体二聚化刺激其转变为活跃状态。

3.3. 整合药效团及共价对接的虚拟筛选策略

自20世纪90年代始，随着组合化学与高通量筛选技术的兴起，药物设计的重心从先导化合物的优化转向了先导化合物的发现。同期，计算机辅助的虚拟组合化学库设计，以及基于分子对接和药效团的数据库虚拟筛选技术，使得研究人员能够在计算机上对大量化合物进行预筛选，大幅降低了实验合成和筛选的需求，从而显著提升了药物研发的效率。在这一时期，“类药性”这一概念、“五倍率”规则以及ADMET (吸收、分布、代谢、排出和毒性)属性等关键因素，也被逐步发展和广泛应用于药物分子的设计过程中。

Figure 4. Multi-target JAK inhibitor screening based on big data

图4. 基于大数据的多靶点JAK抑制剂筛选

药效团模型能够识别药物分子与靶标之间的关键相互作用，如氢键、疏水作用、电荷相互作用等，从而指导设计具有活性的化合物。随着新的药效团构建算法以及对JAK结构的探索逐渐完善，使得基于共同特征药效团建模、共价对接的方法被应用于JAK抑制剂的筛选，Qiu等人[13]通过共同特征药效团建模、共价对接和共识评分来识别JAK3的新型抑制剂，基于选择的代表性共价JAK3抑制剂构建了共同特征药效团模型。事实证明，最佳定性药效团模型在区分活性和非活性化合物方面非常有效。在不断的对药效团的相关理论研究过程中人们发现在药物设计中存在着一种特定的、不易被清除的药效团模式，对于实现药物的有效性和持久性是成功的，这在药物的筛选和优化过程中发挥了关键的作用，Liyun Zhao等人[14]，在对与癌症相关靶点的HDAC/JAK双靶点抑制剂研究过程中，通过连接子(linker)将两种协同作用的靶点抑制剂药效团组合成一个分子，提高了药物的利用效率。同时，随着大数据，云计算等技术的出现，集合一些数据库，基于针对多靶点的药效团混合筛选和分层方法也逐渐应用于JAK抑制剂的筛选中，一方面这样拓宽了靶点筛选的维度为更多可能的有活性的结果提供了可能。Dávid Bajusz等人对一个庞大的供应商数据库进行了细致筛选[15]，成功筛选出了亚微摩尔级别的JAK1抑制剂以螺环吡咯嘧啶类化合物为主化合物(如图4)，为开发新一代JAK1特异性抑制剂提供了新的参考。Alessia Bono等人[16]，为美国国家癌症研究所(NCI)数据库，经过ADME评估工具筛选。来筛选多靶点的JAK抑制剂，并取得了较好的筛选结果。

基于已经获得的靶点信息对分子对接即在计算机中模拟分子识别的过程，其目的是通过使用分子力学方法或者量子化学方法计算小分子之间分子识别蛋白及其配体的最佳结合构象，确保复合物整体的结合自由能最低。是研究者们一直关注的问题之一在研究ATLIII如何通过抑制Jak3/Stat3信号通路来降低IDO的表达的实验中Jun-bao Liu等人[17]通过使用分子对接实验预测了ATLIII与JAK3蛋白的结合活性和位点，随后通过一系列的生物实验进一步证实了这一点。张天泰等人在研究类风湿关节炎的治疗药物时作者开发了一种新的不可逆共价JAK3选择性抑制剂Z583 (如图5)，通过与JAK3亚型中第909位(Cys909)半胱氨酸残基结合抑制JAK-STAT通路，阻止小鼠胶原诱导关节炎(CIA)的进展。Z583是治疗自身免疫或炎症性疾病的极有希望的候选药物[18]。

Figure 5. Molecular docking suggests atractylenolide III (ATLIII) binds closely to the Leu905 site of Jak3. (A) ATLIII interaction with Jak3 protein. (B) Jak3 inhibitor 19R interaction with Jak3 protein. (C) Jak3 inhibitor 7KV interaction with Jak3 protein

图5. 分子对接实验预测白术内酯III (ATLIII)与Jak3蛋白的Leu905位点紧密结合。(A) Jak3蛋白与ATLIII的相互作用图。(B) Jak3蛋白与抑制剂19R的相互作用图。(C) Jak3蛋白与抑制剂7KV的相互作用图

3.4. 化学信息学以及药代动力学的量化处理

如何使用计算机表达化学以及生物上的一些结构是科学家一直致力于探索的领域，随着计算机技术的不断发展，一些化学以及生物信息的处理方法正不断被应用于药物的虚拟筛选当中[19]。传统的小分子信息处理多依赖于二维或三维的图片作为信息的储存于处理方法，然而这样的方法有着明显的缺陷，二维或者三维的图片虽然能够很好的展示分子的结构信息，便于阅读者接受，但是，这种图片信息在计算机中要占据大量的储存空间，不便于其进行大规模的处理与分析，因此一些一维的分子结构编码方式如：系统命名码、线性码、碎片码、连接表等方式被开发出来以适应计算机的储存方式，其中SMILES (Simplified molecular input line entry system)，简化分子线性输入规范，广泛的被应用于小分子药物库以及有机化学文献检索数据库中，它能够被大多数分子编辑软件导入转换成分子的二维图形或三维模型，同时由于其简洁、方便的表示化学结构信息以及相对完备的“语法”体系使得在处理过程中能够完整的储存分子的官能团以及立体结构信息(如表1)。

Table 1. In the SMILES system, branches in molecules are represented by “()”, double bond cis-trans isomerism is indicated by “/” and “\”, and chiral atoms in enantiomers are denoted by “[]”, with “@” representing counterclockwise and “@@” representing clockwise

表1. 在SMILES体系中，分子中分支用“()”表示；用“/”和“\”表示双键顺反异构；对映异构中的手性原子用“[]”，@表示反时针，@@表示顺时针

Figure 6. Generate the virtual compound by Library enumeration; the synthesis route of JAK3 inhibitor

图6. 通过文库枚举生成虚拟化合物；JAK3抑制剂的合成路线

在JAK3共价抑制剂组合库设计中，通过对分子的smiles字符解析Thorarensen等人[20]报道的PF-06651600为模板，并根据其发现过程中系列化合物的合成路线，在数据处理平台上，使用rdkit组件，构建了针对jak3共价抑制剂候选小分子的反应枚举库。筛选提供了坚实的理论基础。Yanli Wang等人的研究中[21]，首先用分子对接方法虚拟筛选一个含107238化合物的内部数据库；然后用两个专用的JAK激酶结构过滤器对命中化合物进行过滤，以出去不满足条件的化合物；然后用基于能量最小化的MM-GB/SA对化合物打分，再用激酶结构过滤器进行一轮的过滤，保留500个打分最优的化合物进入下一轮计算评估；最后用基于分子动力学模拟的MM-GB/SA进一步对化合物进行打分，最终选择了8个化合物进入最实验测试。Reymond等人[22]使用枚举法创建了包含1664亿个有机分子的GDB-17数据库用于筛选JAK抑制剂的先导化合物(如图6)。通过对研究体系的理解建立的虚拟筛选库不仅可以应用于当前的药物筛选，更是为后期的基于结构的优化以及后续的使用深度学习等相关筛选方法铺平了道路。

3.5. 基于机器学习以及深度学习的筛选方法

1950年图灵测试问世以来，人工智能在医疗领域的应用不断进步(如图7)。1975年，首个医学计算机研究资源诞生，NIH随后举办的AI研讨会凸显了其在医疗中的重要性。2000年代深度学习的兴起和2007年DeepQA系统的推出扩大了AI的应用[23]。2010年，CAD首次用于内窥镜检查，2015年出现了首个药物机器人。2017年，首个FDA批准的云基深度学习应用标志着AI在医疗领域的正式应用，随后在2018至2020年间，胃肠病学领域进行了多项AI试验。而机器学习作为人工智能的一个分支，可以让计算机从数据中学习模式和特征，从而在没有明确编程的情况下做出决策或预测，即机器执行智能任务的能力[24]。机器学习背后的核心思想是，不是编写一个将输入转换为输出的算法，而是可以训练一个分类器，该分类器基于输入和输出的对生成某种算法，然后可以将其用于未见输入以提供新的输出。在虚拟筛选的背景下，这意味着我们可以创建一个模型，该模型在经过包含已知绑定化合物和已知不绑定化合物的数据集训练后，可以预测给定化合物是否会与给定靶点结合[25]。找到这样的模型并不容易。必须在训练集上的准确性和对未见数据的泛化能力之间找到平衡。如果过于重视训练数据上的性能，那么就有过度拟合的风险，这将导致在测试数据上表现不佳。然而，性能不佳也可能来自一个欠拟合的分类器。平衡这些极端的策略被称为结构风险最小化原则[26]。不同的分类器有不同的遵循结构风险最小化的方式。

Figure 7. History of artificial intelligence in healthcare

图7. 人工智能在健康医疗上的进展

近年来，机器学习作为一种强大的数据驱动的方法，被广泛应用于JAK抑制剂的发现和设计。Sharath Belenahalli Shekarappa等人[27]，收集了含有6021种独特抑制剂的JAK2蛋白的实验数据。然后，我们根据Morgan (ECFP6)指纹对它们进行特征描述，并根据它们的分子支架将它们聚类为训练集和测试集。将其用于集中机器学习模型当中确定了九种潜在分子。同时随着一些公共开源的药物信息库，以及靶点信息库的问世为药物化学研究者们提供丰富的训练数据来源。同时，随着计算机的算力的提升使得机器学习可以进一步发展成为深度学习，深度学习是一种特殊的机器学习方法，它使用多层神经网络来学习数据的复杂模式，它的优点在于自动从原始数据中学习到层次化的特征表示，减少了对手工特征工程的依赖。并且可以直接从原始数据输入到最终的任务输出(如分类或回归)，无需中间的特征提取和转换步骤。Lei He等人[28]，使用深度强化学习用于学习现有JAK2和SMO的小分子抑制剂的特性，并生成一个可能能够同时抑制JAK2和SMO的新的小分子化合物库。随后，通过分子对接对该分子库进行了筛选，共选出了7种作为JAK2和SMO的双重抑制剂。Yimeng Wang等人[29]使用ChEMBL，PubChem BindingDB作为数据集的来源(如图8)，从中收集四种JAK亚型抑制剂及实验IC50值并用RDKit和MOLsv对分子结构进行了规范化、去盐、去电荷去重等操作，作者还将IC50值转换为PIC50值，以保证模型建立的稳定性。在PyTorch框架3的GPU版本上训练了Attentive FP模型。最终得到了13,898个化合物，用于下一步的筛选。

Figure 8. Relevance analysis on individual endpoint values and input features for the full data. a. Heat map showing the correlation among the pIC50 values of the four JAK subtype small molecular inhibitors, darker colors indicated higher relevance. b. The QED fraction distributions of the small molecules in the four tasks are plotted, the more overlapped regions the more compatible the compounds are

图8. 对整个数据的个体端点值和输入特征进行相关性分析。a. 热图显示四个JAK亚型小分子抑制剂pIC50值之间的相关性，颜色越深表示相关性越高。b. 绘制了四个任务中小分子的QED分数分布，重叠区域越多，化合物的兼容性越好

4. 总结与展望

基于计算机的辅助药物设计技术在前期的靶点发现后的探索性研究中，特别是在靶点蛋白的结构研究新结构药物发现中，相较于传统的基于实验筛选的方式具有高效经济的优势，针对不同的研究方向需要结合两种甚至多种技术进行分析，例如在原靶点蛋白的新位点的发现中通过分子对接以及可视化蛋白质结构软件进行初步的分析，进而使用分子动力学对蛋白与配体的结合进行进一步的分析以观察，在新的母核以及新的结构片段发现中，使用rdkit结合python或knime等相关平台进行高通量的化学信息处理，有助于研究者根据研究靶点搭建虚拟筛选分子库，进行以数据驱动的机器学习。不难看出，在未来的药物发现中。新技术的出现对研究人员提出了新的要求，研究人员不仅要具备传统的生物测试、化学合成等单一方向的实验能力，还需要生物、化学、计算机等技术的综合能力。在这种研究方式下，药物研发将越来越向着便捷、高效、智能的方向发展。

参考文献