1. 引言
蛭类(leeches)，俗称蚂蟥，是环节动物门(Annelida)蛭纲(Hirudinea)动物的统称。中国蛭类资源丰富，约占世界蛭类物种数的1/6 [1]。根据生活环境的不同，通常可将蛭类大体上区分为“水蛭”和“陆蛭”。多数“水蛭”分布于淡水水域，少数种类栖息于海水。“陆蛭”主要是指山蛭科(Haemadipsidae)的种类，栖息于山林中，也称“山蛭”或“山蚂蟥”，依靠前、后吸盘进行尺蠖式或蠕虫式爬行运动，嗜吸路人、牲畜及野生动物的血液[2]。
随着研究的不断深入，山蛭科历经了多次修订。目前，除了有学者将山蛭科的陆蛭属(Chtonobdella)升格为陆蛭科(Chtonobdellidae) (内含38种) [3]-[5]以外，其余的山蛭科种类被修订为3属，即山蛭属(Haemadipsa)、三颚四环蛭属(Tritetrabdella)和中国洞蛭属(Sinospelaeobdella) [6] [7]。迄今，我国已记录山蛭属共15种4亚种[1] [8] [9]，包括琉球山蛭(H. rjukjuana)、海南山蛭(H. hainana)、日本山蛭(H. japonica)、彩纹山蛭(H. picta)和天目山蛭(H. tianmushana)。
天目山蛭是我国的特有种，主要分布于长江流域以南，多生活在温暖湿润的山区灌草丛中及枯枝落叶间，属东洋界种类[10]，但在我国北方也陆续发现了天目山蛭的分布[10]-[13]。1996年，在河南省黄河北岸济源县的太行山区(35˚15′N, 112˚05′E)也发现了天目山蛭的分布，这使其分布区由长江流域向北推移了约400 km。此后，该区域即作为我国天目山蛭分布的最北缘[13]。
最近，我们在山西历山国家级自然保护区云蒙核心区科学考察期间，于云蒙核心区采集到一种山蛭标本，经形态学观察和mtDNA COI基因的系统发育关系分析，将其鉴定为天目山蛭。这不仅是天目山蛭在山西省境内的首次发现，也是迄今已知的天目山蛭分布的最新北缘，对于蛭类地理分布、行为生态和系统发育的深入研究具有一定的参考价值。
2. 材料与方法
2.1. 标本采集及形态特征观察
2024年4~9月，我们在山西历山国家级自然保护区(35˚16'30''~35˚27'20''N，111˚51'10''~112˚05'35''E，海拔620~2358 m)进行了云蒙核心区科学考察。该保护区位于山西省南部，中条山脉东段，地处运城、晋城、临汾三个地市的垣曲、阳城、沁水、翼城四县毗邻地界。该区属暖温带季风型大陆性气候，是东南亚季风的边缘，气候温暖，雨量充沛，自然条件优越。调查期间，我们于云蒙核心区(表1)采集到16条山蛭标本(编号为SX01-SX16)。将活体标本用软毛刷小心装入矿泉水瓶内，并适量放入采集地周围的杂草和水，瓶口用两层纱布封盖以保证瓶内气体流通，维持其正常的生活状态。
Table 1. Collection information of land leech specimens in this study
表1. 本研究所使用的山蛭标本的采集信息
采集时间 |
采集地点 |
经纬度 |
海拔 |
生境 |
采集位置 |
坡位 |
坡向 |
2024.04.28 |
三龛底 |
35˚18'56.93''N |
680 m |
针阔混交林、小河边 |
沟谷 |
西 |
112˚00'45.33''E |
2024.07.27 |
落凹村 |
35˚17'37.33''N |
809 m |
针阔混交林、小溪边 |
坡下位 |
北 |
112˚01'01.62''E |
2024.08.29 |
后花石沟 |
35˚20'10.69''N |
1087 m |
针阔混交林 |
坡下位 |
北 |
112˚02'19.76''E |
2024.08.29 |
后花石沟 |
35˚20'17.02''N |
952 m |
针阔混交林、小河边 |
沟谷 |
北 |
112˚01'33.84''E |
将标本带回室内，先对其进行外形特征观察与拍照。然后，将其置于玻璃养殖箱内(箱底平整地放置一张A4纸大小、具有1 mm × 1 mm方格的坐标纸)，观察其在箱底进行自由伸缩及尺蠖状或爬行运动时的状态，使用铅笔和数显式游标卡尺(精度0.01 mm)标记和测量蛭体在箱底极度拉伸状态下的体长、静息状态下的体长、最大体宽、吸盘直径等体型指数。然后，参考《中国动物志·环节动物门·蛭纲》一书中介绍的方法对活体标本进行麻醉和整形处理[14]，随后对其进行形态学观测，主要观测指标包括眼点数量、体表乳突、生殖孔位置及间隔环数、辐射肋的数量、耳状突等重要的物种鉴别特征。有些活体标本经过清水冲洗干净之后，直接用95%的乙醇溶液保存，以备分子鉴定之用。标本保存于吉首大学生物资源与环境科学学院动物标本室。
2.2. DNA提取、扩增与测序
将泡入95%乙醇溶液中的标本取出，剪取其尾吸盘的一小块肌肉，送至生工生物工程(上海)股份有限公司(简称“生工生物”)，用Ezup柱式动物组织基因组DNA抽提试剂盒(B518251)提取DNA，使用蛭类通用引物LCO1490/HCO2198进行mtDNA COI基因扩增[15]。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环10次，最后72℃总延伸30 s。将扩增后的PCR产物进行检测及纯化后测序。
2.3. 数据处理
使用EXCEL软件统计分析形态学数据。将DNA测序结果在NCBI上运行Blast程序，下载一些亲缘关系较近的蛭类mtDNA COI基因序列用于碱基比对，再使用MEGA11计算修正后的序列之间的遗传距离，并用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)构建系统发育树。最后综合外形特征与分子数据，对标本进行物种鉴定。
3. 结果与分析
3.1. 形态学特征
本次采集的山蛭标本体型较大，略呈圆锥状，背面稍隆起，腹面较平整，蛭体前三分之二与后三分之一不均等地向两端变狭，分界部位最为宽阔。静息状态时体长6.25~27.74 mm，最大体宽2.31~9.57 mm，尾吸盘直径1.47~6.82 mm (表2)。蛭体共有27(体)节97(体)环，第6环之后为口后环。生活时，背部深棕色，有许多不规则的斑纹和斑点，背中有一条贯穿全身的灰褐色细线，细线两侧有两对不连续的黑色纵纹。感觉乳突明显，呈乳白色。腹面较背面色淡，中间有一较狭长的淡黄色条带，条带两侧有两条棕色纵纹，纵纹与条带之间分布着许多深色斑纹，排列不规则。蛭体两侧各有一条无斑点的浅色区带，几乎从第6环一直连续至第90环，两区带靠背侧各有一深色条纹将浅色区带和背部分隔开。眼点5对，依次位于第2、3、4、5和8环的背侧，第3、4对眼点之间被两个多角形小区隔开。雄性生殖孔位于第30/31环的环沟上，雌性生殖孔位于第35/36环的环沟上，两孔间隔5环。位于第94~96环上的3对耳状突显著，呈三角形，中间一对较小。肛门位于最后一个体环(第97环)与尾(后)吸盘的交界处，为一弧形小孔。尾吸盘近圆形，背面粗糙，有不规则斑点，腹面辐射肋有73~74条(图1)。
Figure 1. External morphological characteristics of the land leeches from Shanxi province, China: (a) Live dorsal view; (b) Live ventral view; (c) Live lateral view; (d) Ventral view of caudal sucker after short-term storage in 95% ethanol solution
图1. 山西的山蛭标本的外形特征：(a) 活体背面观；(b) 活体腹面观；(c) 活体侧面观；(d) 95%乙醇溶液短期保存后的尾吸盘腹面观
山西的山蛭标本(山西山蛭)与天目山蛭的形态测量数据如表2所示，可见：同一发育阶段，山西山蛭比天目山蛭的体型大；山西山蛭在自主拉伸状态下的最大体长约为静息状态时的两倍；在不同发育阶段，它们的伸缩性各不相同，其中山西山蛭的伸缩性指数(EI)为：幼体0.86、亚成体1.00、成体1.06，均小于天目山蛭的EI指数(幼体1.61、亚成体1.14、成体1.23)。这表明，山西山蛭(北方的)的伸缩能力小于(南方的)天目山蛭。
Table 2. Comparison of morphological data of the live land leech specimens from Shanxi with the live specimens of Haemadipsa tianmushana from the Baiyunshan reserve, Hunan (mean ± SD, mm)
表2. 山西的山蛭活体标本与湖南白云山的天目山蛭活体标本的形态学数据比较(mean ± SD, mm)
指标 |
山西的山蛭标本 |
湖南白云山的天目山蛭 |
幼体 (N = 5) |
亚成体 (N = 6) |
成体 (N = 5) |
幼体 (N = 6) |
亚成体 (N = 6) |
成体 (N = 5) |
静息状态体长 |
10.29 ±2.31 |
13.61 ± 2.01 |
23.63 ± 4.16 |
6.38 ± 0.92 |
9.55 ± 1.14 |
14.41 ± 2.39 |
自主拉伸状态最大体长 |
19.19 ± 3.16 |
27.25± 3.47 |
48.69 ± 11.03 |
16.63 ± 1.40 |
20.43 ± 2.25 |
32.09 ± 5.44 |
最大体宽 |
3.90 ± 0.89 |
5.26 ± 1.01 |
8.30 ± 1.30 |
2.61 ± 0.33 |
3.61 ± 0.50 |
5.99 ± 0.66 |
尾(后)吸盘直径 |
2.53 ± 0.60 |
3.62 ± 0.34 |
5.74 ± 0.95 |
1.74 ± 0.28 |
2.56 ± 0.52 |
4.04 ± 0.74 |
EI |
0.86 |
1.00 |
1.06 |
1.61 |
1.14 |
1.23 |
注：EI为蛭类的“伸缩性指数”(elongation index)，可用于比较不同蛭种的伸缩能力。计算公式EI = (自主拉伸状态时的最大体长–静息状态时的体长)/静息状态时的体长。天目山蛭活体标本于2024年10月6日采自湖南白云山国家级自然保护区境内(28˚37'42''~28˚50'58''N，109˚16'35''~109˚30'52''E，海拔约1050 m)。
3.2. 分子数据分析
对测序结果进行处理，获得长度为684 bp的mtDNA COI基因序列。通过NCBI Blast检测，山西山蛭与分布于湖南白云山的天目山蛭的相似度最大，高达97.63%，而与琉球山蛭(Haemadipsa rjukjuana)的相似度仅为87.74%。基于mtDNA COI基因序列构建的系统发育树结果显示，山西山蛭与天目山蛭聚为一支，而琉球山蛭单独形成另一支(图2)。遗传距离分析显示，山西山蛭与天目山蛭的平均遗传距离为2.86%，与山蛭属其他物种的平均遗传距离为16.47% (表3)。据此，山西山蛭应归属于天目山蛭。
Figure 2. Phylogenetic tree constructed by ML method based on mitochondrial mtDNA COI gene (The number on the tree indicating the bootstrap value; SX2024-1 and SX2024-2 are the numbers of the land leech specimens from Shanxi province, China)
图2. 基于mtDNA COI基因用ML法构建的系统发育树(发育树各分支上的数字表示自展值；SX2024-1和SX2024-2 为采自山西的山蛭标本编号)
Table 3. Genetic distances between the land leech specimens from Shanxi and other relative species in the genus Haemadipsa based on mtDNA COI gene sequences
表3. 基于mtDNA COI基因序列计算的采自山西的山蛭标本与山蛭属其他亲缘物种之间的遗传距离
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No.of GenBank |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
Haemadipsa tianmushana |
1. SX2024-1 |
|
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|
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2. SX2024-2 |
0.0048 |
|
|
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|
3. MG195985 |
0.0278 |
0.0295 |
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|
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|
Haemadipsa rjukjuana |
4. KC524508 |
0.1257 |
0.1316 |
0.1337 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5. KC524509 |
0.1275 |
0.1295 |
0.1315 |
0.0064 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Haemadipsa japonica |
6. LC427762 |
0.1566 |
0.1546 |
0.1467 |
0.1744 |
0.1722 |
|
|
|
|
|
|
|
|
7. LC427761 |
0.1587 |
0.1566 |
0.1487 |
0.1765 |
0.1743 |
0.0064 |
|
|
|
|
|
|
|
8. LC427763 |
0.1627 |
0.1606 |
0.1526 |
0.1723 |
0.1701 |
0.0048 |
0.0081 |
|
|
|
|
|
|
Haemadipsa picta |
9. HQ322471 |
0.1766 |
0.1766 |
0.1784 |
0.1725 |
0.1644 |
0.1333 |
0.1333 |
0.1295 |
|
|
|
|
|
10. HQ322470 |
0.1785 |
0.1785 |
0.1804 |
0.1704 |
0.1623 |
0.1330 |
0.1312 |
0.1331 |
0.0261 |
|
|
|
|
11. HQ322472 |
0.1787 |
0.1787 |
0.1805 |
0.1745 |
0.1664 |
0.1353 |
0.1353 |
0.1314 |
0.0016 |
0.0278 |
|
|
|
Haemadipsa hainana |
12. HQ322473 |
0.1831 |
0.1895 |
0.1793 |
0.1808 |
0.1850 |
0.1859 |
0.1903 |
0.1880 |
0.1912 |
0.1914 |
0.1934 |
|
|
13. PP262132 |
0.1917 |
0.1982 |
0.1857 |
0.1872 |
0.1914 |
0.1925 |
0.1968 |
0.1945 |
0.1936 |
0.1936 |
0.1958 |
0.0097 |
|
4. 讨论
天目山蛭是1977年宋大祥建立的一个新种[16]，其主要鉴别特征是：背部色深，有许多不规则的斑纹及斑点，两侧边之间共有6条黑色纵纹，腹面有两条平行的棕色纵纹，腹中有一狭窄的浅色区带[14]。本次在山西省境内发现的天目山蛭活体标本总体上符合以上鉴别特征。可是，前人对该物种的一些形态学特征的描述也不尽相同，例如有关尾吸盘的形状就有桃形、圆形等不同的记述，这或许是不同的研究人员在标本处理和观测方面存在差异所致。本研究对标本外形的观察与测量均在活体时进行，不同于该物种以往的形态描述如下：山西山蛭第3、4对眼点之间被两个多角形小区隔开；背部黑色纵纹在前、中、后段均有断裂；生活时尾吸盘成圆盘形。综合分子数据的分析和形态学特征的比较，虽然不同的生活环境可能使得山西山蛭与湖南的天目山蛭略有差异，但这仍属于种内差异，因此我们将山西山蛭鉴定为天目山蛭。
比较分析发现，山西的天目山蛭明显比湖南白云山的天目山蛭体型大，但前者的伸缩能力弱于后者。我们认为，这是生活环境差异所致。山西的纬度较高，年平均气温较低，在长期对寒冷环境的适应性进化过程中，天目山蛭可能趋向于大型化和少运动，因此体型较大，伸缩性较弱。当然，北方的天目山蛭种群比南方的天目山蛭种群的个体大，这是否具有普遍意义，值得今后予以深入研究。天目山蛭主要分布于我国长江流域以南的温暖湿润山区，多见于浙江、湖北、湖南、四川、广东、海南等地[13] [14]，河南济源的太行山区是其分布区的北缘[13]。本研究不仅是山西省蛭类动物的新纪录，还再次将天目山蛭的分布区向北推移了约8 km，这也是迄今已知的天目山蛭分布的最北缘。
5. 结论
天目山蛭分布广，栖息环境丰富多样，其体型和体色都可能因环境条件的不同而产生不同程度的差异，因此形态学鉴定通常存在一定的困难，本研究将形态学比较和mtDNA COI基因的系统发育分析相结合，为今后天目山蛭的分类鉴定和物种演化的深入研究提供了新的参考。此外，本研究发现，山西的天目山蛭比湖南白云山的天目山蛭体型大而伸缩性小，由此推测，北方的天目山蛭比南方的天目山蛭体型大而伸缩性小，这是否具有普遍性值得今后深入研究。本研究不仅是天目山蛭在山西省的新记录，同时也将天目山蛭的分布区向北推移了8 km，山西历山保护区成为天目山蛭分布的新北缘。
基金项目
国家自然科学基金资助项目(32160241)、山西历山国家级自然保护区云蒙核心区科学考察项目(1499002024CCS00234)。
致 谢
在本项目标本采集和研究的过程中，得到了山西历山国家级自然保护区管理局局长徐茂宏、山西省生物多样性保护中心主任朱军的支持与帮助，谨此一并致以诚挚的谢意。
NOTES
*通讯作者。