1. 引言
近年来，磁性氧化铁纳米颗粒(γ-Fe2O3/Fe3O4)已被广泛应用于磁共振成像[1] [2]、肿瘤治疗[3]、药物递送[4]、细胞分离[5]等领域。在磁共振造影方面，氧化铁纳米粒的超顺磁性使得它们能改变生物体内局部组织中水质子的弛豫速率[6]，从而产生强烈的磁共振信号，显著提高成像的对比度和清晰度，可替代具有潜在肾源性系统性纤维化风险的钆类化合物，有潜力成为新一代安全有效的磁共振造影剂[7] [8]。
为了得到尺寸均一、形状可控的氧化铁纳米粒，通常选择在高温、无水条件下进行的热分解法，该方法操作简单，条件可控，易于批量放大[9] [10]。然而，热分解法制备的氧化铁纳米粒表面存在大量油酸等疏水性物质，这极大限制了其在生物医学领域的应用，这需要进一步通过表面修饰来提高纳米粒的亲水性。其中，聚乙二醇(PEG)修饰是一种增强氧化铁纳米粒水溶性的有效策略[2] [11]，同时PEG分子的引入还降低了蛋白质吸附和免疫反应，提高了纳米粒的生物相容性和血液循环时间[12]。
在氧化铁纳米粒的表面修饰过程中，PEG通过配体交换来取代纳米粒表面的油酸，然而该取代过程并不完全，残留的油酸可能影响纳米粒的亲水性，导致弛豫效率降低，影响其造影效果[13]。因此，对表面化学修饰物的精确分析是实现氧化铁纳米粒临床应用的关键。然而，准确、快速检测配体交换后纳米粒表面油酸残留量的方法尚不明确。热重分析常用于检测纳米粒表面配体的覆盖量[14] [15]，由于修饰后的氧化铁纳米粒表面含有PEG和残留的油酸，该方法并不能区分两者之间的比例，无法准确得到油酸和PEG各自的含量。Davis等使用14C标记的油酸合成氧化铁纳米粒，通过高灵敏的液体闪烁计数法检测配体交换前后纳米粒表面的14C-油酸覆盖量[16] [17]，但是该纳米粒的制备过程中需使用特殊标记的油酸，不适合作为常规分析手段。高效液相色谱法操作简便、分析速度快，并且具有高灵敏度、高分辨率和良好的重复性而被广泛采用[18]-[21]。
本研究拟通过热分解法制备油酸覆盖的γ-Fe2O3纳米粒，使用甲氧基聚乙二醇2000-磷酸(mPEG-P)进一步修饰得到mPEG-P覆盖的γ-Fe2O3纳米粒(γ-Fe2O3-PEG)，采用高效液相色谱法准确检测γ-Fe2O3-PEG纳米粒表面的油酸残留量。并通过改变γ-Fe2O3/mPEG-P投料比制备出了表面具有不同残留油酸的γ-Fe2O3-PEG纳米粒，通过观察纳米粒体外磁共振T1加权成像的差异，考察残留的油酸对γ-Fe2O3-PEG纳米粒造影效果的影响。最后，对本研究制备的γ-Fe2O3-PEG纳米粒与上市的钆布醇造影剂进行了小鼠体内磁共振成像拍摄，探究γ-Fe2O3-PEG纳米粒的临床应用潜力。
2. 材料与方法
2.1. 主要药品与试剂
油酸铁、油酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；油醇、二苯醚(上海麦克林生化科技有限公司)；甲氧基聚乙二醇2000-磷酸(重庆渝偲医药科技有限公司)；钆布醇(拜耳医药保健有限公司)；实验室用水为超纯水。
2.2. 主要仪器
UV2600紫外分光光度计(岛津公司)；Zetasizer Pro动态光散射纳米粒度分析仪(马尔文仪器有限公司)；高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；7T小动物核磁共振成像系统(布鲁克公司)；透射电子显微镜(美国FEI公司)。
2.3. 动物
ICR小鼠(杭州子源实验动物科技有限公司)，雄性，7~8周。本研究严格遵循动物福利伦理原则，所有实验操作均已获得重庆医科大学实验动物福利委员会的正式批准。
2.4. γ-Fe2O3-PEG纳米粒的制备
首先，将0.57 g油酸、1.61 g油醇、1.8 g油酸铁和10 g二苯醚加入到250 mL三口烧瓶中，在氮气保护下加热至250℃，反应30 min，得到γ-Fe2O3纳米粒，随后使用丙酮沉淀、洗净，在正己烷中保存备用[9]。取质量比为1:4的γ-Fe2O3纳米粒子和mPEG-P于1 mL乙醇和1 mL正庚烷的混合溶剂中，60℃孵育12 h。反应结束后，使用正己烷沉淀得到γ-Fe2O3-PEG纳米粒，超纯水溶解，使用20 kD透析膜透析2天以除去游离的PEG，4℃保存备用。
2.5. γ-Fe2O3与γ-Fe2O3-PEG纳米粒的表征
吸取10 μL γ-Fe2O3、γ-Fe2O3-PEG纳米粒溶液样品滴于铜网上，室温干燥，待溶剂挥发完全，将铜网置于透射电子显微镜下进行扫描拍照，使用Nano Measurer 1.2统计400个γ-Fe2O3纳米粒子的直径。取适宜浓度的纳米粒溶液1 mL，置于粒径样品池中，采用Zs-Pro测定样品的动态光散射粒径。
2.6. Fe3+浓度含量测定
吸取样品溶液0.5 mL，加入0.5 mL盐酸，超声10 min，依次加入10%盐酸羟胺溶液0.5 mL，0.15%菲啰啉溶液1 mL，1 mol/L乙酸钠溶液5 mL，超纯水稀释至25 mL，摇匀，放置30 min，在510 nm波长下测定吸光度。
2.7. 纳米粒表面油酸含量检测
2.7.1. 样品前处理
取1 mL γ-Fe2O3-PEG样品溶液于25 mL烧瓶中，加入0.5 mL盐酸，超声10 min，将溶液旋蒸挥干。烧瓶中加入3 mL正己烷，超声提取瓶内壁的油酸，收集正己烷层(油酸层)溶液，再次使用正己烷重复超声提取2次，将3次得到的正己烷溶液合并。最后将正己烷溶液旋干，使用10 mL甲醇复溶，样品溶液使用0.22 μm滤膜过滤，装入进样瓶中备用。
2.7.2. 高效液相色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(78:22)；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。
2.7.3. 方法学考察
线性关系考察：配制10、20、40、60、80、100、200、400 μg/mL的油酸对照品溶液，按2.7.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品浓度(X, μg/mL)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归。
精密度试验：取油酸对照品溶液，按2.7.2项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。
稳定性试验：取供试品溶液，在制备后0、1、2、4、8、12、24 h时，依次按照2.7.2项下色谱条件进样，记录峰面积。
重复性试验：按照2.7.1项下制备6份供试品溶液，按2.7.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算油酸含量。
加样回收试验：取6份供试品溶液，每份加入200 μg的油酸对照品，按照2.7.1项下制备样品及2.7.2项下色谱条件进样测定，计算回收率。
2.7.4. 单个纳米粒表面油酸覆盖率计算
假设纳米粒全部由γ-Fe2O3构成，半径为r nm的规则球形。γ-Fe2O3纳米粒的密度为5.24 g/cm3，单个纳米粒重量为2.19 r3 × 10−20 g，γ-Fe2O3分子量为160 g/mol，单个纳米粒含有γ-Fe2O3的摩尔数为1.37 r3 × 10−22 mol，单个纳米粒含有Fe3+的摩尔数为2.74 r3 × 10−22 mol，根据测得的油酸与Fe3+的摩尔比，可计算得出单个纳米粒表面覆盖的油酸的摩尔数，进而得到单个纳米粒表面油酸的个数。
2.8. 不同油酸残留量的Fe2O3-PEG纳米粒制备
采用不同质量比例的γ-Fe2O3和mPEG-P (1:1、1:2、1:3、1:4)投料制备得到γ-Fe2O3-PEG纳米粒，按照2.7.1、2.7.2项下方法分析表面油酸的覆盖率。
2.9. 体外磁共振成像
分别测定Fe3+浓度为0.5、1 mmol/L的不同γ-Fe2O3/mPEG-P投料比制备的γ-Fe2O3-PEG纳米粒在7T磁共振成像系统中的体外T1加权成像，考察不同油酸残留量对γ-Fe2O3-PEG纳米粒造影效果的影响。测试条件如下：核磁拍摄序列为T1-RARE，重复时间350 ms，回波时间8 ms，回波间隙8.5 ms，层数9，视野30 mm × 20 mm，矩阵256 × 256。
2.10. 体内磁共振成像
为了验证γ-Fe2O3-PEG的体内造影效果，选择体外成像最优的γ-Fe2O3/mPEG-P投料比例制备得到的γ-Fe2O3-PEG纳米粒进行了小鼠体内7T磁共振血管成像测试，并与商用试剂钆布醇进行了对比。小鼠尾静脉注射200 μL样品溶液(以Fe3+和Gd3+剂量为0.1 mmol/kg计算)，小鼠麻醉后以趴卧位卧于小动物线圈中，持续通入麻醉气体麻醉，随时调整气流量保持心律及呼吸稳定后，分别拍摄注射前与注射后30 min的躯干部位冠状面核磁图像。测试条件如下：核磁拍摄序列为TOF-3D-FLASH-FIC，重复时间15 ms，回波时间2.4 ms，视野38 mm × 30 mm × 25 mm，矩阵256 × 256 × 64。核磁TOF序列成像图像重建使用软件RadiAnt DICOM Viewer重建，重建方式选择最大密度投影重建。
2.11. 统计学分析
利用Graphpad Prism 8.0.1软件进行统计学分析，计量资料以(Mean ± SEM)表示，两组之间比较采用t检验。以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3. 结果与分析
3.1. γ-Fe2O3与γ-Fe2O3-PEG纳米粒的表征
纳米粒的粒径表征结果如图1和表1所示。透射电镜下观察到热分解法制备的γ-Fe2O3纳米粒尺寸为2.7 ± 0.35 nm (图1(A))，大小分布均匀，呈球状结构。动态光散射测量的γ-Fe2O3纳米粒在正己烷中的水合粒径为11.95 ± 0.25 nm (图1(B)、表1)，比透射电镜下观察到的粒径大，这是由于动态光散射法检测的是纳米粒的水合粒径。使用mPEG-P修饰后，在透射电镜下观察到γ-Fe2O3-PEG纳米粒仍处于高度分散状态，无聚集现象(图1(C))，其水合粒径为63.69 ± 0.56 nm (图1(D)、表1)，大于γ-Fe2O3纳米粒的粒径，这是因为mPEG-P分子链比油酸更长，并且mPEG-P具有亲水性，使纳米粒表面能结合更多的水分子，增大了水化层。
Figure 1. Particle size characterization
图1. 纳米粒的粒径表征
Table 1. Dynamic light scattering results of γ-Fe2O3 and γ-Fe2O3-PEG nanoparticles (n = 3, comparison between the two groups, ****P < 0.0001)
表1. γ-Fe2O3与γ-Fe2O3-PEG纳米粒的动态光散射结果(n = 3，两组间比较，****P < 0.0001)
样品 |
分散介质 |
粒径(nm) |
Polydispersity Index |
γ-Fe2O3 |
正己烷 |
11.95 ± 0.25 |
0.2337 ± 0.0051 |
γ-Fe2O3-PEG |
水 |
63.69 ± 0.56**** |
0.2279 ± 0.0052 |
3.2. 纳米粒表面油酸覆盖率检测
3.2.1. 高效液相色谱条件
按照2.7.2项下高效液相色谱条件进样，得到的油酸对照品及γ-Fe2O3-PEG样品的色谱图见图2 (A：油酸对照品；B：样品)，油酸出峰时间为27 min，样品中目标成分的分离度良好。
Figure 2. High-performance liquid chromatography
图2. 高效液相色谱图
3.2.2. 方法学考察
方法学考察结果显示，油酸在10~400 μg/mL浓度范围内线性回归方程为Y = 4 083X − 2 212.1 (r2 = 1)，线性关系良好(图3)；精密度试验中油酸峰面积的RSD为0.64% (n = 6)，表明仪器精密度良好；γ-Fe2O3-PEG纳米粒溶液按照2.7.1项下处理后，油酸峰面积的RSD为1.29%，待测液在24 h内稳定；平行处理得到6份样品溶液，测得溶液中油酸的平均含量为681.7 μg/mL，RSD为3.50%，表明该方法重复性良好；加样回收试验结果如表2所示，计算得到油酸的平均回收率为99.86%，RSD为1.56%，说明使用本方法测定油酸含量结果准确可靠。
Figure 3. Calibration curve of oleic acid
图3. 油酸标准曲线
Table 2. Results of oleic acid recovery (n = 6)
表2. 油酸加样回收试验结果(n = 6)
样品含量(μg) |
加入量(μg) |
测定量(μg) |
回收率(%) |
平均回收率(%) |
RSD (%) |
476.2 |
200 |
670.24 |
97.02 |
99.86 |
1.56 |
476.2 |
200 |
678.79 |
101.30 |
476.2 |
200 |
676.45 |
100.13 |
476.2 |
200 |
678.71 |
101.26 |
476.2 |
200 |
675.40 |
99.60 |
476.2 |
200 |
675.87 |
99.84 |
3.2.3. 不同γ-Fe2O3/mPEG-P投料比制备的纳米粒表面油酸覆盖量
γ-Fe2O3及不同投料比制备得到的γ-Fe2O3-PEG纳米粒表面油酸覆盖量分析结果如表3、图4所示，采用高温热分解法制备得到的γ-Fe2O3纳米粒表面含有大量油酸，其单个纳米粒上覆盖的油酸个数为324.86。使用mPEG-P进行修饰后，纳米粒表面的油酸数量明显降低，并且随着mPEG-P投料比的增加，单个纳米粒上残留油酸的数量逐渐减少，当mPEG-P达到最高比例1:4时，γ-Fe2O3-PEG纳米粒上油酸个数为33个，约为初始油酸量的10%。mPEG-P与γ-Fe2O3表面油酸的配体交换，为自由取代的过程，当在反应体系中增加mPEG-P的浓度时，取代反应正向进行，与γ-Fe2O3结合的mPEG-P逐渐增多，γ-Fe2O3-PEG纳米粒上的油酸减少，与检测数据一致，同时也反映了本研究油酸定量测定的准确性。
Table 3. Residual oleic acid on the surface of γ-Fe2O3, γ-Fe2O3-PEG nanoparticles (n = 3)
表3. γ-Fe2O3、γ-Fe2O3-PEG纳米粒表面油酸残留量(n = 3)
γ-Fe2O3:mPEG-P投料比 |
单个纳米粒表面油酸个数 |
pre |
324.86 ± 1.46 |
1:1 |
100.17 ± 0.85 |
1:2 |
83.30 ± 0.59 |
1:3 |
56.48 ± 0.73 |
1:4 |
32.98 ± 0.53 |
Figure 4. Residual oleic acid levels of γ-Fe2O3 and γ-Fe2O3-PEG nanoparticles (n = 3, ****P < 0.0001)
图4. γ-Fe2O3、γ-Fe2O3-PEG纳米粒表面油酸残留量(n = 3, ****P < 0.0001)
3.3. 体外磁共振成像
不同油酸残留量的γ-Fe2O3-PEG纳米粒溶液体外磁共振T1加权成像结果如图5所示，以Fe3+浓度为0 mmol/L的纯水作为对照。随着mPEG-P投料比由1:1增大至1:4，T1加权像依次变亮，表明油酸残留量的减少，能促进γ-Fe2O3-PEG纳米粒的T1造影性能。这是由于油酸的存在，使γ-Fe2O3周围形成了疏水区，减少了与水的相互作用。根据内–外球模型，T1造影剂效率与内球机制有关，通过增加与γ-Fe2O3直接接触的水分子数量，可以增强γ-Fe2O3的T1造影效果[22]。随着本研究使用的mPEG-P增加，γ-Fe2O3纳米粒表面的油酸残留量降低，形成的疏水区逐渐减小，与水的相互作用逐渐增大，使得纳米粒的T1造影性能增强。
Figure 5. T1-weighted magnetic resonance imaging of γ-Fe2O3-PEG nanoparticles at different Fe3+ concentrations
图5. 不同Fe3+浓度下的γ-Fe2O3-PEG纳米粒T1加权磁共振成像
3.4. 体外磁共振成像
γ-Fe2O3-PEG纳米粒与钆布醇在小鼠体内的磁共振血管成像结果如图6所示，由图可知，注射药物前，磁共振图片中只能观察到小鼠的部分腹主动脉，但磁共振信号较低且血管轮廓模糊。γ-Fe2O3-PEG纳米粒经尾静脉注射后30 min，腹主动脉的亮度增加，血管轮廓更为清晰，中部的肾动脉细小血管在图片中也能呈现出来。然而，钆布醇在给药30 min后，腹主动脉轮廓虽然比给药前有所改善，但仍未观察到腹部细小血管。因此，γ-Fe2O3造影剂与目前临床使用的钆布醇试剂相比，有更好的血管成像效果。
Figure 6. Magnetic resonance angiography in mice
图6. 小鼠体内磁共振血管成像
4. 结论
本研究通过热分解法制备了粒径为2.7 nm的γ-Fe2O3纳米粒，并通过mPEG-P配体交换除去纳米粒表面覆盖的大量油酸，改善纳米粒的水溶性。为了解决修饰后纳米粒表面油酸定量测定的问题，本研究采用高效液相色谱法，使用C18硅胶色谱柱，在203 nm波长处检测油酸的含量，方法学考察结果显示，各项指标均符合要求，可以作为氧化铁纳米粒表面油酸残留量的测定。此外，为了探究油酸对磁共振成像效果的影响，本研究通过改变γ-Fe2O3和mPEG-P的投料比，得到了不同油酸残留量的γ-Fe2O3-PEG纳米粒。结果表明，随着纳米粒表面油酸的减少，纳米粒的T1加权成像能力增强。最后，γ-Fe2O3-PEG纳米粒在小鼠体内的血管成像效果优于上市的钆布醇试剂，临床应用潜力显著。该研究为γ-Fe2O3纳米粒表面油酸的分析提供了一种准确、快速的高效液相色谱检测方法，同时建立了γ-Fe2O3-PEG纳米粒造影效果的体外评价方式，有望促进氧化铁类造影剂的商业化生产和应用。
基金项目
“重庆英才计划”创新领域人才(重点产业领域)项目(CQYC20220305379)。
NOTES
*通讯作者。