1. 引言
姜黄饮片为姜科草本植物姜黄的干燥根茎经炮制后的类圆形洁净厚片，性味辛、苦，温。归脾、肝经。可行气破瘀，通经止痛[1]。姜黄既可入药，亦可食用，安全无毒，FDA批准姜黄提取物为天然食品添加剂[2]。目前，有关姜黄的化学成分、药理作用、临床应用以及质量控制等方面的研究备受关注。研究表明，姜黄中的有效成分有姜黄精油、总姜黄素类、姜黄多糖等，具有抗炎抑菌[3]-[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]-[9]、治疗帕金森[10]-[12]、保肝[13]等多种药理活性。但不同产地姜黄的质量参差不齐[14]，因此，对临床所用的姜黄饮片进行质量分析和抑菌活性分析，颇具研究意义。
2. 仪器与材料
AX224ZH型电子天平(奥豪斯)，KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山)，Agilent1260型高效液相色谱仪(美国)，WFH-201B型紫外投射反射仪(上海精科)，MOTIC麦克奥迪数码显微镜(合肥麦思高)，FCD-3000型干燥箱(上海琅玕)，RE-2000A型旋转蒸发仪(巩义予华)，DH-500A型培养箱(北京中兴伟业)。
姜黄饮片(本市医药超市购买)，标准品姜黄素(CUR，批号74-09-19)、去甲氧基姜黄素(DMC，批号B21015)、双去甲氧基姜黄素(BDMC，批号B50675)均购自上海源叶生物科技公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌种，均由西安医学院医学技术学院提供。本研究已获得西安医学院医学伦理审查委员会批准(批准编号：XYLS2022261)。
乙腈、甲醇(HPLC，天津科密欧)，其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
3. 方法与结果
3.1. 姜黄饮片的性状
姜黄饮片为类圆形厚片，外表皮深黄色并可见环节，切面呈棕黄色角质样，内皮层可见明显环纹，维管束明显呈点状散在。本品散发的气香特异，味苦、辛。
3.2. 姜黄饮片的检查
采用甲苯法(中国药典通则0832第四法)测定水分，得姜黄饮片含水量均低于6.0%。
取混匀的姜黄饮片粉末约2.5 g，精密称定，置于灼烧至恒重的坩埚中，精密称定重量，于马弗炉中缓缓灼烧至完全碳化时，逐渐升高温度至550℃，使完全灰化并灼烧至恒重。计算得本品的总灰分含量均低于5.0%。
3.3. 姜黄饮片的鉴别
3.3.1. 显微鉴别
取粉碎后的姜黄饮片粉末适量置于载玻片，使用胶头滴管滴加间苯三酚试剂和浓盐酸各1滴，并装片加热，显微镜检。清晰可见表皮细胞扁平，有薄壁木质化细胞，如木化纤维(图1(A))、梯纹导管(图1(B)、图1(C))、网纹导管(图1(D))、木薄壁细胞(图1(E))。取姜黄饮片粉末少许，分别以水装片，显微镜检，清晰可见油滴(图1(F))和非腺毛(图1(G))；另加碘液1滴，显微镜检，即显蓝色，检视淀粉粒存在(图1(H))。另取姜黄饮片粉末少许置于载玻片中央装片，使用胶头滴管滴加10% α-萘酚的乙醇试液和硫酸各1滴，显微镜检，显紫红色，检视多糖存在(图1(I))。
Figure 1. Microscopic identification of turmeric slices
图1. 姜黄饮片的显微鉴别图
3.3.2. 薄层鉴别
取姜黄饮片细粉0.2 g，于具塞试管中，加无水乙醇20 ml，振摇，放置1 h，滤过，蒸干，加无水乙醇2.0 ml使溶解，得供试品溶液。分别取供试品溶液和0.5 mg/ml姜黄素(CUR)对照品溶液各5 μl，于硅胶G薄层板上点样。以无水乙醇–苯–氯仿(2:49:49，体积比)为展开剂，先饱和后展开，置紫外灯(365 nm)下检视，结果见图2(A)。同法，以无水乙醇–30%氨水–正丁醇(1:3:30，体积比)为展开剂，检视结果如图2(B)。由图可见，姜黄素斑点的比移值和顺序发生明显变化，这是展开剂的极性发生改变所致。
Figure 2. TLC chromatogram of turmeric
图2. 姜黄的薄层色谱图
3.3.3. 理化鉴别
取姜黄饮片粉末少许置于试管中，用胶头滴管滴加乙醇和乙醚各2滴，振荡，呈黄色；再加入硼酸饱和溶液2滴，振荡，则逐渐转变为橙红色；再加入氨试液2滴，振荡，则转变为蓝黑色，随后又逐渐转变为褐色(如图3(A))；继续振荡后室温久置，溶液又转变为橙红色(如图3(B))。用胶头滴管另取硫酸和乙醇各1滴，置于点滴板上混匀，然后加入饮片粉末少许，混合均匀，则呈紫红色(如图3(C))，以检视姜黄饮片中姜黄素的存在。
Figure 3. Physicochemical identification of turmeric slices
图3. 姜黄饮片的理化鉴别
3.4. 姜黄饮片HPLC含量测定
3.4.1. 溶液的制备
对照品溶液的制备：分别取姜黄素(CUR)、去甲氧基姜黄素(DMC)、双去甲氧基姜黄素(BDMC)标准品各适量，精密称定，分别于10 ml棕色容量瓶中加甲醇分别制成浓度均为0.50 mg/ml标准原液，4℃贮存备用。使用前按需稀释，并分别移取一定体积配制成混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：取粉碎后的姜黄饮片粉末约1.0 g，电子天平精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml无水乙醇，称重，于超声振荡清洗器中超声30 min，功率100 W，放冷至室温，称重，用无水乙醇补重，摇匀。离心，精密移取上清液2.00 ml于50 ml棕色容量瓶，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。进样前使用针用0.45 µm微孔滤膜过滤。
3.4.2. 色谱条件与系统适用性试验
Agilent Eclipse plus C18反相键合色谱柱(100 × 4.6 mm, 3.5 µm)，以乙腈-4%冰醋酸溶液(48:52)为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为430 nm，室温，进样量为5 μl。在该色谱条件下测得姜黄素的理论塔板数n > 8000，三种姜黄素类化合物的色谱峰的分离度R > 1.5，峰的对称因子fs均在0.95~1.05范围内。其混合对照品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图见图4。
1——双去甲氧基姜黄素(BDMC)；2——去甲氧基姜黄素(DMC)；3——姜黄素(CUR)
Figure 4. HPLC chromatogram of mixed reference substance (A) and turmeric sample solution (B)
图4. 混合对照品(A)和姜黄供试品溶液(B)的HPLC谱图
3.4.3. 姜黄素类化合物标准曲线的制备
分别精密移取混合对照品溶液0.15、0.50、1.00、1.75、2.50、4.00、5.00 ml置于10 ml容量瓶中，甲醇稀释并定容，摇匀。在上述色谱条件下分别进样测定，以浓度x (µg/ml)为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性拟合，得三种姜黄素类化合物的线性关系见表1。
Table 1. Linear relationship of curcumin compounds
表1. 姜黄素类化合物的线性关系
化合物 |
线性拟合方程 |
相关系数r |
线性范围(µg/ml) |
姜黄素(CUR) |
y = 36.37x − 40.39 |
0.9993 |
1.35~45.00 |
去甲氧基姜黄素(DMC) |
y = 35.32x − 54.60 |
0.9990 |
1.56~52.00 |
双去甲氧基姜黄素(BDMC) |
y = 73.44x − 10.46 |
0.9991 |
0.45~15.00 |
3.4.4. 方法学考察
本实验采用中国药典中姜黄药材的含量测定方法[1]，同时进行了精密度、重复性、稳定性、加样回收率等方法学考察[13]。在上述色谱条件下，对混合对照品溶液(中间浓度)重复连续进样6次，测得三种姜黄素类成分的保留时间及峰面积的RSD均低于1.5%。对同一批次姜黄饮片制备的6份供试品溶液进样，测得三种姜黄素类成分的保留时间及峰面积的RSD均低于2.2%。并将其中一份供试品溶液分别避光放置1、2、4、8、12、24 h后进样，测得三种姜黄素类成分的保留时间及峰面积的RSD均低于1.8%。对同一批已知含量的姜黄饮片，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液制备9份供试品溶液，进行加样回收实验，测得三种姜黄素类化合物的回收率均在95%~103%内，RSD均低于2.1%。以上结果表明，本实验精密度、重复性、稳定性、加样回收率均良好，实验方法可靠。
3.4.5. 姜黄素类化合物的含量测定
取6批姜黄饮片(S1~S6)，按供试品溶液的制备方法各平行制备3份试样。分别在上述色谱条件下测定，计算三种姜黄素类化合物的百分含量，其中姜黄素含量均大于1.0% (结果见表2)。
Table 2. Determination results of curcumin compounds
表2. 姜黄素类化合物的测定结果
编号 |
BDMC (%) |
DMC (%) |
CUR (%) |
S1 |
0.22 |
1.39 |
1.32 |
S2 |
0.32 |
0.99 |
2.86 |
S3 |
0.41 |
1.04 |
1.82 |
S4 |
0.65 |
1.83 |
1.77 |
S5 |
0.53 |
1.25 |
2.02 |
S6 |
0.31 |
0.95 |
1.57 |
3.5. 姜黄饮片提取液的抑菌性实验
抑菌活性试验采用单片纸碟法。移取姜黄饮片提取液1.0 ml于灭菌离心管中，将直径为6 mm的滤纸片若干灭菌，再浸入姜黄饮片提取液中并置于37℃恒温干燥箱，挥发除去溶剂后备用。称取33.0 g营养琼脂，加入1000 ml蒸馏水中，加热煮沸使琼脂充分溶解，在121℃、102 MPa灭菌20 min制成培养基[15]，待降温至50℃~60℃，于超净台将制备好的培养液倾入经同法灭菌的培养皿中，放冷，凝固后备用。将所需细菌接种在培养皿中，然后贴上试先备用的浸有药液的滤纸片，置于37℃培养箱中培养24 h后，测量抑菌圈直径的大小(分别平行实验三次取平均值，结果见表3)。
Table 3. Results of antibacterial test (n = 3)
表3. 抑菌实验结果(n = 3)
样品 |
抑菌圈平均直径/cm |
大肠杆菌 |
金黄色葡萄球菌 |
乙型副伤寒杆菌 |
绿脓杆菌 |
肺炎克雷伯菌 |
姜黄素溶液 |
1.02 |
1.05 |
1.03 |
1.01 |
1.06 |
姜黄提取液 |
1.12 |
1.19 |
1.16 |
1.14 |
1.25 |
实验结果表明，姜黄提取物具有广谱抑菌活性，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌等均有一定的抑制作用，对肺炎克雷伯菌的抑制活性最强；且姜黄饮片提取液比姜黄素溶液的抑菌活性稍高。这可能是因为姜黄提取物具有的抑菌活性与其破坏细菌膜结构的作用密切相关[5] [16]。本实验采用无水乙醇超声提取法所获得的姜黄提取物的有效成分主要有姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素等，后者可能会增加细菌胞膜通透性，破坏细胞膜的完整性，使胞内的蛋白、多糖等内容物外漏而皱缩，还会影响细胞能量代谢，使细菌胞内ATP酶活力和ATP含量显著降低，引发细菌防御系统崩溃或死亡，从而使姜黄提取液的抑菌活性高于姜黄素溶液的抑菌活性。
4. 结论
本实验通过对姜黄饮片的性状、水分和灰分检查、鉴别(包括显微鉴别、薄层鉴别、理化鉴别)和含量测定等进行质量分析，各项分析结果均符合中国药典2020年版(一部)规定，该方法可确保姜黄药材原料的一致性。另外，姜黄饮片提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌等均有一定的抑制活性，且姜黄饮片提取液比姜黄素溶液的抑菌活性稍高。该研究可为姜黄药材的质量控制和抑菌药方研发提供一定参考。
基金项目
陕西省科技计划项目(2023-JC-YB-766, 2023-JC-QN-0629)；大学生创新创业训练计划项目(S202311840053, 121523053)；西安医学院科研能力提升计划项目(2022NLTS073)。
NOTES
*通讯作者。