1. 引言

生产车间洁净区环境主要依靠空气净化系统的净化作用，但是洁净区域必然存在净化死角，人员、物品进入洁净区也可能引入外源微生物，由此给生产带来污染的风险，合理地选择消毒剂和消毒控制措施就显得尤为重要[1] [2]。

传统的洁净区消毒剂一般采用常见的消毒剂进行搭配使用[3]-[5]，例如75%酒精、次氯酸钠、季铵盐、新洁尔灭等，而75%酒精、新洁尔灭等这类消毒剂无法有效地杀灭细菌芽孢[6] [7]。随着科技的发展，化学消毒剂的相关技术也在不断进步，因此，从降低风险的角度出发，必须要保证所选用的消毒剂能够对各类细菌都起到较好的杀灭效果。杀孢子剂是一款新型的广谱杀菌剂[8]，主要有效成分包含过氧化氢、过氧乙酸等，作用机制主要是通过破坏微生物的细胞壁或细胞膜，使其失去活性，对微生物进行快速杀灭、抑制，其中包括细菌、真菌、病毒和细菌孢子等，特别是应用于孢子杀灭，因此目前已广泛应用于制药、生物制品制造、化妆品生产以及保健品生产等各个领域的GMP车间中洁净区内设备表面及环境的消毒。目前市面上杀孢子剂的品牌很多，比如进口品牌舒安美、国产新兴品牌。产品使用方式也各不相同，有浓缩型、即用型等，各品牌的主要成分含量均不相同，例如舒安美浓缩型含有10%~25%醋酸，而欣祐及微寇浓缩型不含该成分。因此本研究拟探讨不同品牌以及不同类型的杀孢子剂的消毒效果比较，为本企业洁净区杀孢子剂的选择提供指导依据。

消毒剂的消毒效果验证是用来评价消毒剂有效性的主要方式[9]，根据实际应用的需求，可以选择不同的评价方法，本实验将以洁净区表面消毒实验的方法进行6种杀孢子剂的消毒效果的验证。

2. 材料与方法

2.1. 设备

生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、电热恒温培养箱(广东环凯微生物科技有限公司)、高压蒸汽灭菌器(致微(厦门)仪器有限公司)。

2.2. 试剂耗材和试验菌株

胰酪大豆胨琼脂培养基(240223A10)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(240111A10)、磷酸盐缓冲液(231129A20)，采样规格板(5 cm × 5 cm)，硫代硫酸钠(20230816)，吐温80 (E1513120)，卵磷脂(TY2230724-36)，牛血清白蛋白(A31IS224626)，均来自广东环凯微生物科技有限公司。

金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、藤黄微球菌(FSCC(I)321104，车间环境监测分离株)、枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)、白色念珠菌(ATCC10231)，均来自广东环凯微生物科技有限公司。选择细菌、芽孢、真菌及车间中存在的环境分离株各一株为代表进行实验。

2.3. 杀孢子剂和中和剂

本实验所使用的杀孢子剂和中和剂见表1。舒安美浓缩型(有效成分为过氧化氢20%~30%，过氧乙酸5%~6%，醋酸10%~25%)，欣祐浓缩型(有效成分为过氧化氢25%，过氧乙酸4.5%)，微寇浓缩型(有效成分为20%~24%过氧化氢，5%~7%过氧乙酸)，舒安美即用型(有效成分为过氧化氢3.09%，过氧乙酸0.1%)，舒博即用型(有效成分为过氧化氢1%，过氧乙酸0.08%)，微寇即用型(有效成分为过氧化氢0.8%%~1.2%，过氧乙酸0.06%%~0.1%)，根据其有效成分选择相应的中和剂进行验证[10]。

Table 1. Sporicidal agents and neutralization reagents

表1. 杀孢子剂及其中和剂

2.4. 中和剂验证实验

中和剂验证实验选用金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为试验菌，参照《消毒技术规范》的方法[11]进行菌株培养，均用0.9%无菌生理盐水溶液稀释至浓度为10⁷~10⁸ cfu/ml的菌悬液。参照《消毒技术规范》[11]的中和剂悬液定量鉴定试验程序进行操作，实验分组见表2。

中和效果评价：试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格。

1) 第1组无菌生长或仅有极少数生长。

2) 第2组无菌生长或较第1组多，但较第3、4、5(组)为少的试验菌生长。

3)第3、4、5(组)有相似量试验菌生长且满足回收菌落数1 × 10⁷ cfu/ml~5 × 10⁷ cfu/ml之间。其组间菌落数误差率应不超过15%，阴性对照无菌生长。

第3、4、5组间菌落数误差率计算公式如下：

$组间菌落数误差率=\frac{\left(三组间菌落平均数-各组菌落平均数\right)的绝对值之和}{3\times 三组间菌落平均数}\times 100\%$

Table 2. The identification test of neutralization reagents

表2. 中和剂验证试验

2.5. 杀孢子剂消毒效果验证

实验分组及操作方法见表3，按照各品牌杀孢子剂推荐的使用浓度和作用时间进行操作，其中试验组和阳性对照组各5个平行实验。菌悬液制备，参照《消毒技术规范》的方法[11]对试验菌株进行培养，实验菌量应在1.25 × 10⁷ cfu/样本~1.25 × 10⁸ cfu/样本，染菌时，选不锈钢台面较平的部位，于采样规格板中央空格内用无菌棉拭蘸取菌悬液均匀涂抹，待自然干燥后进行试验。

Table 3. Disinfection effectiveness verification of sporicidal agents

表3. 杀孢子剂效果验证

将试验组、阳性对照组和阴性对照组，每份吸取1.0 ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，其中细菌使用胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，细菌及白色念珠菌于37℃培养48 h，细菌芽孢于37℃培养72 h，观察并计数。按下式计算杀灭对数值：

杀灭对数值(KL) = 对照组平均菌落数的对数值(No) − 试验组菌落数对数值(Nx)

消毒效果评价：阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00，可判为该杀孢子剂在所测试物体表面上可以杀灭99.9%以上试验的微生物。

3. 结果

3.1. 中和剂验证

实验结果见表4中。金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在编号1、2的平板上均无菌落生长，在编号3、4、5生长的菌落数均在1.3 × 10⁷ cfu/ml~4.1 × 10⁷ cfu/ml之间，符合回收菌落数在1 × 10⁷ cfu/ml~5 × 10⁷ cfu/ml的要求，各组杀孢子剂对金黄色葡萄球菌的组间菌落数误差率分别为4.3%、2.5%、2.5%、2.6%、2.5%、1.7%，各组杀孢子剂对白色念珠菌的组间菌落数误差率分别为6.7%、6.7%、6.7%、9.5%、6.7%、7.1%，均不超过15%，阴性对照无菌生长。表明所选择的中和剂能够有效中和6种杀孢子剂对细菌和真菌的杀灭作用，适合作为这6种杀孢子剂的中和剂。

Table 4. The identification test result of neutralization reagents

表4. 中和剂验证实验结果

3.2. 杀孢子剂消毒效果验证

实验结果见表5。6种杀孢子对4种试验菌株的杀灭对数值在6.68~7.14之间，均具有大于3个Log值的杀灭能力，且各组杀孢子剂对4个试验菌株的杀菌能力差别不大，其消毒效果均能够满足生产车间洁净区消毒效果的要求。

Table 5. Killing log value of sporicidal agents

表5. 杀孢子剂杀灭对数值

4. 结论与讨论

本实验对6种杀孢子剂分别进行了中和剂中和效果和杀孢子剂的消毒效果验证试验。试验结果表明，以含1%吐温80、0.5%硫代硫酸钠和0.5%卵磷脂的磷酸盐缓冲液作为中和剂，可以有效中和舒安美浓缩型、欣祐浓缩型、微寇浓缩型杀孢子剂对试验菌株的杀灭作用，以含2%硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液作为中和剂，可以有效中和舒安美即用型、舒博即用型、微寇即用型杀孢子剂对试验菌株的杀灭作用，且中和剂、中和产物对受试菌株及培养基无明显影响。研究结果显示，按照各品牌的推荐方法进行使用，6种杀孢子剂对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌(环境分离株)、枯草芽孢杆菌黑色变种、白色念珠菌均具有大于3个Log值的杀灭能力，即用型与浓缩型的消毒效果无明显差异，不同品牌之间无明显差异。本公司洁净区的污染微生物主要为葡萄球菌、微球菌属及芽孢杆菌属，在本验证实验中进行了上述菌株的消毒效果验证，表明这6种杀孢子剂均能满足洁净车间消毒的要求。环境菌株可能存在耐消毒剂基因或长期存在于消杀环境中，为适应环境而产生基因突变[12]，为进一步选择更适合的消毒剂，应选用大量的车间洁净区环境中分离菌株进行测试。

洁净车间生产过程中避免微生物污染是生产企业质量管理的核心内容，使用消毒剂对生产环境进行清洁消毒是企业控制微生物水平、保证产品安全性的主要手段之一。本研究参照《消毒技术规范》[11]对消毒剂性能验证的要求，使用标准菌株及洁净车间中监测分离的环境菌，选取与洁净区设备材质相同的载体，通过中和剂鉴定试验、消毒剂对物体表面消毒试验，验证了6种杀孢子剂在洁净区的消毒效果，为洁净区清洁消毒策略的制订及清洁消毒的有效性提供了依据。洁净区理想的消毒剂应当具有广谱杀菌、对人体和产品无毒、无腐蚀性、作用迅速、低成本等特点。本实验中杀孢子剂具有无毒、无残留、广谱杀菌等特点，对所测试微生物(包括芽孢)的杀灭对数值均达到标准要求，其杀灭效果较好，可以在洁净区环境的大面积消毒和B + A级洁净区小区域消毒中作为消毒剂使用。

生产洁净区微生物控制是一项持续、严谨的工作。由于长时间使用同一种消毒剂会使微生物产生耐药性[13]，造成消毒效果下降，因此，企业可根据环境监测趋势结果，制定和洁净区相对应的消毒周期，并定期更换消毒剂种类，在应用后对使用情况进行监测和回顾分析，有效降低洁净区微生物污染风险。随着国内外化学消毒剂技术的不断进步，应当关注相关领域的发展，以便不断提高洁净区环境控制的管理水平。

本研究涉及的微生物菌株为安全等级三级的ATCC菌株和环境中分离的菌株，均为实验室能有效控制感染的菌种，且实验操作在二级生物安全柜内进行，有效保护了实验人员和环境，符合生物安全伦理原则。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献