1. 引言
多酚类化合物广泛存在于各种水果、蔬菜和谷物中，是植物体内的最常见的复杂酚类次生代谢产物，具有抗氧化等生物活性作用[1]-[3]，而人类许多疾病的发生与机体氧化损伤有关[4]，因此，多酚是国内外学者认可的可预防和改善心血管类、代谢类等疾病的重要植物次生代谢产物。与代谢类疾病的临床常见化学合成药物相比，植物中的多酚类成分具有原料来源广、副作用小等优点[5] [6]，因此，多酚类化合物作为天然来源的“绿色”活性物质，已经成为药食两用植物的开发研究热点。
覆盆子(Rubus chingii Hu)是蔷薇科、悬钩子属植物华东覆盆子的成熟果实，同时也是药食两用食物[7]。浙江是覆盆子的主产地，覆盆子已入选浙江新“浙八味”。目前，对覆盆子中多酚的研究主要集中在提取工艺优化[8]，所得的多酚粗提物多酚含量较低仍需进一步富集。钟等利用大孔树脂对覆盆子多酚进行富集所得覆盆子多酚纯度为54.18% [9]，纯度仍然不高。因此，寻找富集更高纯度覆盆子多酚的方法十分必要。
本研究以覆盆子乙醇提取物即覆盆子多酚粗提物为材料，以大孔树脂对覆盆子多酚的吸附量和解吸率为指标，从不同极性的常见大孔树脂中筛选富集覆盆子多酚的最佳大孔树脂，并推断大孔树脂的吸附动力学模型，了解大孔树脂吸附覆盆子多酚的吸附过程；通过单因素试验和正交优化试验，优化上样液pH、多酚上样量、解吸液乙醇体积分数等参数，确定富集覆盆子多酚工艺条件；并对比富集前后覆盆子多酚的多酚纯度、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny-l-2-picrylhydrazyl, DPPH)清除力、对黄嘌呤氧化酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，通过分子对接研究覆盆子主成分与黄嘌呤氧化酶和α-葡萄糖苷酶的结合情况。旨在为覆盆子多酚资源充分开发利用提供基础。
2. 材料和方法
2.1. 仪器和试剂
高速多功能粉碎机购自永康天祺盛世有限公司；CT 15RE日立台式离心机购自德国艾本德股份公司；RotavaporR-210旋转蒸发仪购自瑞士Buchi公司；ZQTY-70台式恒温振荡培养箱购自上海知楚仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计购自日本岛津公司；BT224S电子天平购自北京赛多利斯仪器有限公司。
乙醇、盐酸均为分析纯，乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH购自美国Sigma公司；没食子酸、鞣花酸、维生素C、别嘌醇、黄嘌呤氧化酶、α-葡萄糖苷酶、各极性大孔树脂等购自上海源叶有限公司，大孔树脂参数如表1。
Table 1. Various macroporous resin parameters
表1. 各种类大孔树脂参数
树脂种类 |
极性 |
粒径/mm |
比表/m2/g |
孔径大小/nm |
S-8 |
极性 |
0.3~1.25 |
100~120 |
28~30 |
HP-20 |
中极性 |
0.25~0.85 |
500~600 |
7.5~8 |
AB-8 |
弱极性 |
0.3~1.25 |
480~520 |
13~14 |
DM301 |
弱极性 |
0.3~1.25 |
330~380 |
13~17 |
D101 |
非极性 |
0.2~0.6 |
550~650 |
9~10 |
X-5 |
非极性 |
0.3~1.25 |
500~550 |
29~30 |
2.2. 材料
当季覆盆子中药材干品购自浙江省磐安嘉德堂、安徽省绍蔷中药堂。选取完整的覆盆子，再干燥至恒重后粉碎，备用。
2.3. 方法
2.3.1. 覆盆子中鞣花酸含量的测定
浙江产、安徽产覆盆子粉末各以1:10料液比加入60%乙醇，480 W超声提取30 min，过滤，滤液定容于容量瓶。鞣花酸标准品用氢氧化钠促溶，甲醇溶解[10]。鞣花酸标准品和覆盆子提取液过22 μm滤膜后进样，参考文献[11]的方法测定覆盆子中鞣花酸含量。色谱柱：Ultimate®XB-C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，流速：1 mL/min，进样量10 μL，柱温：40℃，紫外检测器检测波长254 nm，流动相组成：A，乙腈；B，0.2%磷酸水。洗脱梯度：0~8 min 15%B，8~23 min 33%B，23~39 min 42%B，39~45 min 28%B，45~60 min 15%B。
2.3.2. 覆盆子多酚粗提物的制备
以鞣花酸含量较高的覆盆子作为本试验的研究对象，制备覆盆子多酚粗提物。覆盆子粉末以1:20料液比加入去离子水，室温下480 W超声提取30 min，去除覆盆子中可溶性糖，过滤，滤渣按1:20料液比加入60%乙醇，室温下480 W超声提取30 min，滤液浓缩、真空干燥至恒重，得覆盆子多酚粗提物。
2.3.3. 大孔树脂的筛选
参考文献[12]的方法，对大孔树脂进行预处理。参考文献[13]的方法，取预处理后大孔树脂按1:20料液比加入一定质量浓度的覆盆子多酚粗提物水溶液，室温200 rpm下充分振荡10 h，过滤，测定滤液的多酚浓度，吸附后的大孔、树脂用蒸馏水冲洗备用。取吸附后的大孔树脂按1:20料液比加入80%乙醇，室温和200 rpm下充分振荡10 h，过滤，测定滤液的多酚浓度。计算大孔树脂对覆盆子多酚的吸附量和解吸率，选择最适合富集覆盆子多酚的大孔树脂。
(1)
(2)
2.3.4. 大孔树脂静态吸附和解吸动力学曲线的测定
取大孔树脂按1:40料液比加入一定质量浓度的覆盆子多酚粗提物水溶液，室温和200 rpm下充分振荡10 h，10 h内每隔1 h取1 mL上清液测定多酚含量，绘制静态吸附动力学曲线，确定大孔树脂最佳吸附时间。参考文献[14]的方法计算和分析最佳大孔树脂的吸附动力学模型。
准一阶动力学模型：
(3)
准二阶动力学模型：
(4)
式中，Qe和Qt分别是理论吸附量和瞬时吸附量(mg/g树脂)，k1和k2分别是一阶和二阶动力学速率常数。
吸附完全的大孔树脂加入适量80%乙醇洗脱，洗脱条件同上，隔1 h取1 mL上清液测定多酚含量，绘制静态解吸动力学曲线，确定大孔树脂最佳解吸时间。
2.3.5. 单因素试验
取活化的大孔树脂，按1:20料液比加入适量覆盆子多酚粗提物水溶液，室温和200 rpm下静态吸附完毕后取上清液测定多酚含量，并计算多酚吸附量。分别考察不同上样液pH (3、4、5、6、7)、多酚上样量(10、20、30、40、50、90 mg/g树脂)对大孔树脂静态吸附效果的影响。
取充分吸附覆盆子多酚的大孔树脂，并加入适量乙醇溶液，室温和200 rpm下静态解吸完全后，取上清液测定多酚质量浓度，并计算多酚解吸率。分别考察解吸液不同乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)对大孔树脂静态解吸效果的影响。
2.3.6. 正交优化试验
综合单因素试验结果，设计正交优化试验，确定最佳上样液pH、多酚上样量与解吸液乙醇体积分数等富集参数，制备覆盆子多酚。
2.3.7. 覆盆子多酚的得率、纯度及生物活性测定
参考文献[15]的方法测定多酚含量，计算得率和纯度。DPPH清除率的测定参考文献[16]的方法，以维生素C为阳性对照。黄嘌呤氧化酶抑制活性的测定参考文献[17]的方法，以别嘌醇为阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参考文献[18]的方法，以阿卡波糖为阳性对照。多酚得率和纯度根据以下公式计算：
(5)
(6)
2.3.8. 分子对接
参考文献[19]和[20]的方法，对黄嘌呤氧化酶、α-葡萄糖苷酶和覆盆子主成分鞣花酸进行分子对接，分析受体与配体的结合能和结合方式。
2.3.9. 数据处理
采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，计量资料数据均用平均数±标准差表示，并用LSD法进行组间比较。检验显著性水平α = 0.05。
3. 结果与分析
3.1. 覆盆子中鞣花酸含量测定
根据《中华人民共和国药典》2020版，鞣花酸是评价覆盆子药材质量的关键指标。鞣花酸的高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)图见图1。鞣花酸含量的计算结果见表2，浙江和安徽产地的覆盆子中鞣花酸含量按干品计均大于0.2% [21]，药材质量合格。浙江产覆盆子鞣花酸含量更高，药材质量更好，因此选取浙江产覆盆子作为本研究的实验材料，下面简称“覆盆子”。覆盆子多酚粗提物的得率为18.81% ± 0.18%，多酚含量为238.08 ± 1.75 mg/g。
Figure 1. HPLC diagram of ellagic acid standard (A) and raspberry from Zhejiang (B) and Anhui (C)
图1. 鞣花酸标准品(A)、浙江产地覆盆子(B)和安徽产地覆盆子(C)的HPLC图
Table 2. Adsorption capacity and desorption rate of polyphenols from raspberry by macroporous resins (n = 3)
表2. 各大孔树脂对覆盆子多酚的吸附量和解吸率(n = 3)
样品 |
峰面积 |
鞣花酸含量(mg/g) |
浙江产覆盆子 |
7798.53 ± 33.20 |
3.21 ± 0.02 |
安徽产覆盆子 |
6971.33 ± 24.58 |
2.82 ± 0.01 |
3.2. 富集覆盆子多酚的大孔树脂筛选
3.2.1. 大孔树脂对覆盆子多酚的吸附和解吸能力比较
大孔树脂的性能关键在于其对目的物的吸附和解吸能力。由表3可知，对于覆盆子多酚，AB-8和DM301大孔树脂的吸附量和解吸率较高，且与其他大孔树脂有显著差异(P < 0.05)，推测弱极性大孔树脂更合适，且13~17 nm孔径的大孔树脂中分子筛更贴合覆盆子多酚的结构。因此选取此两种大孔树脂分析其静态吸附和解吸动力曲线、模拟吸附动力学模型，以选出最佳大孔树脂并确定最佳吸附和解吸时间。
Table 3. Adsorption capacity and desorption rate of polyphenols from raspberry by macroporous resins
表3. 各大孔树脂对覆盆子多酚的吸附量和解吸率
大孔树脂 |
吸附量/mg/g树脂 |
解吸率/% |
S-8 |
30.42 ± 0.16b |
82.03 ± 1.57b |
HP-20 |
30.40 ± 0.24b |
83.43 ± 1.89b |
AB-8 |
30.98 ± 0.24a |
88.76 ± 1.58a |
DM301 |
30.79 ± 0.22a |
86.65 ± 2.07a |
D101 |
30.41 ± 0.17b |
82.81 ± 1.80b |
X-5 |
30.34 ± 0.14b |
82.53 ± 1.73b |
注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05)。
3.2.2. 大孔树脂对覆盆子多酚的静态吸附和解吸动力学曲线及吸附动力学模型
大孔树脂的吸附和解吸动力学曲线是评价大孔树脂吸附和解吸效率的重要参数。由图2可知，两种大孔树脂在起始阶段的吸附量较大，后期吸附率逐渐趋于稳定。AB-8大孔树脂在7 h内基本达到吸附平衡，DM301大孔树脂在第8 h吸附量达到平衡，说明AB-8大孔树脂的吸附效率更优。两种大孔树脂的解吸曲线相似，在5 h内基本达到解吸平衡，但AB-8解吸率比DM301更高。
Figure 2. Dynamic curves of adsorption (A) and desorption (B) of polyphenols from raspberry by AB-8 and DM301 macroporous resins
图2. AB-8和DM301大孔树脂吸附(A)和解吸(B)覆盆子多酚的动力曲线
大孔树脂对多酚的吸附过程可用动力学模型来解释。由表4和图3可知，两种大孔树脂的吸附二阶拟合曲线的R2均大于0.99，说明两种大孔树脂吸附覆盆子多酚的过程更符合准二阶动力模型。且AB-8大孔树脂的Qe值大于DM301，说明AB-8大孔树脂吸附性能优于DM301。
因此综合考虑，选择AB-8大孔树脂作为富集覆盆子多酚的最优大孔树脂。确定AB-8大孔树脂对覆盆子多酚的最佳吸附时间为7 h，最佳解吸时间为5 h。
Table 4. The parameters of the curve were fitted by the adsorption kinetics model of AB-8 and DM301 macroporous resin
表4. AB-8和DM301大孔树脂吸附动力学模型拟合曲线的参数
大孔树脂种类 |
模型 |
方程 |
R2 |
Qe/mg/g树脂 |
k2 |
AB-8 |
准一阶模型 |
y = −0.17065x + 2.93376 |
0.8778 |
37.8501 |
0.0227 |
准二阶模型 |
y = 0.02642x + 0.03081 |
0.9973 |
DM301 |
准一阶模型 |
y = −0.17187x + 2.72251 |
0.7965 |
36.9822 |
0.0292 |
准二阶模型 |
y = 0.02704x + 0.02505 |
0.9969 |
Figure 3. Quasi first-order kinetic model of adsorption of raspberry polyphenols by AB-8 (A) and DM301 (B) macroporous resins, quasi second-order kinetic model of adsorption of raspbery polyphenols by AB-8 (C) and DM301 (D) macroporous resins
图3. AB-8 (A)和DM301 (B)大孔树脂吸附覆盆子多酚的准一阶动力学模型、AB-8 (C)和DM301 (D)大孔树脂吸附覆盆子多酚的准二阶动力学模型
3.3. 单因素试验
3.3.1. pH对AB-8大孔树脂吸附覆盆子多酚的影响
上样液pH影响大孔树脂吸附覆盆子多酚的结果如图4所示，AB-8大孔树脂对覆盆子多酚吸附量随上样液pH升高而降低(P < 0.05)，AB-8大孔树脂在上样液pH为3和4时的吸附量最高且无显著差异(P > 0.05)。考虑到pH过低会破坏多酚类化合物的结构，在测试时也会产生沉淀干扰实验结果，工业上调节大量上样液酸碱性的成本高、破坏环境，故选取4作为最佳上样液pH，选取3、4、5作为正交试验的pH范围。
注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05)。
Figure 4. Effect of pH of sample solution on adsorption capacity of AB-8
图4. 上样液pH对AB-8吸附量的影响
3.3.2. 多酚上样量对AB-8大孔树脂吸附覆盆子多酚的影响
多酚上样量影响大孔树脂吸附覆盆子多酚的结果如图5所示，在一定范围内，随着上样液中多酚浓度的增加，AB-8大孔树脂对覆盆子多酚的吸附量逐渐上升(P < 0.05)，当多酚上样量为40 mg/g树脂和50 mg/g树脂时吸附量无显著差异(P > 0.05)，说明多酚上样量为40 mg/g树脂时吸附量基本达到平衡。因此选取40 mg/g树脂作为正交试验的基准水平。
注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05)。
Figure 5. Effect of polyphenol loading on adsorption capacity of AB-8
图5. 多酚上样量对AB-8吸附量的影响
3.3.3. 解吸液乙醇体积分数对AB-8大孔树脂解吸覆盆子多酚的影响
解吸液乙醇体积分数影响大孔树脂吸附覆盆子多酚的结果如图6所示，当解吸液乙醇体积分数为80%，AB-8大孔树脂解吸率达到峰值且与其他有显著差异(P < 0.05)。根据极性相似相溶原理，推测乙醇体积分数为80%时解吸液极性与覆盆子多酚极性最相似，此时覆盆子多酚在解吸液中溶解度最大，而当乙醇体积分数继续增高后，覆盆子多酚因在解吸液中溶解度降低导致解吸率降低。
注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05)。
Figure 6. Effect of ethanol volume fraction on the desorption rate of AB-8
图6. 乙醇体积分数对AB-8解吸率的影响
3.4. 正交试验
在单因素试验基础上，选取上样液pH (A)、多酚上样量(B)、解吸液乙醇体积分数(C)为考察因素，以覆盆子多酚得率为考察指标，设计三因素三水平正交试验表。正交试验设计与结果见表5~7。
Table 5. Orthogonal test factor level table
表5. 正交试验因素水平表
水平 |
|
因素 |
|
A (上样液pH) |
B (多酚上样量) |
C (乙醇体积分数) |
1 |
3 |
30 |
70 |
2 |
4 |
40 |
80 |
3 |
5 |
50 |
90 |
Table 6. Orthogonal experiment design and results
表6. 正交试验设计及结果
试验号 |
|
因素 |
|
多酚得率/% |
A (上样液pH) |
B (多酚上样量) |
C (乙醇体积分数) |
1 |
1 (3) |
1 (30) |
1 (70) |
69.38 ± 1.13 |
2 |
1 |
2 (40) |
2 (80) |
62.79 ± 0.24 |
3 |
1 |
3 (50) |
3 (90) |
55.20 ± 0.47 |
4 |
2 (4) |
1 |
2 |
68.96 ± 0.82 |
5 |
2 |
2 |
3 |
61.22 ± 0.47 |
6 |
2 |
3 |
1 |
53.30 ± 1.56 |
7 |
3 (5) |
1 |
3 |
78.87 ± 0.88 |
8 |
3 |
2 |
1 |
50.14 ± 0.99 |
9 |
3 |
3 |
2 |
47.88 ± 1.33 |
k1 |
187.37 |
217.22 |
172.82 |
|
k2 |
183.48 |
174.15 |
179.63 |
|
k3 |
176.89 |
156.38 |
195.30 |
|
R |
10.48 |
60.84 |
22.48 |
|
Table 7. Results of variance analysis of orthogonal experiment
表7. 正交试验方差分析结果
因素 |
偏差平方和 |
自由度 |
均方 |
F |
P |
A |
56.143 |
2 |
28.072 |
2.200 |
0.137 |
B |
1957.220 |
2 |
978.610 |
76.693 |
0.000 |
C |
265.708 |
2 |
132.854 |
10.412 |
0.001 |
误差 |
255.202 |
20 |
12.760 |
|
|
3.5. 最佳工艺验证
根据正交优化试验结果，三因素的主次水平为B > C > A。因素B和C对多酚得率的影响显著(P < 0.05)。富集覆盆子多酚的最佳条件为B1C3A1，即30 mg/g多酚上样量、90%乙醇体积分数和pH3。以此条件富集覆盆子多酚并进行三次重复试验，获得得率为85.36% ± 0.78%、纯度为68.58% ± 0.60%的覆盆子多酚。该工艺获得的覆盆子多酚得率较高，纯度比原来高出近3倍。
3.6. 覆盆子多酚的生物活性
由表8可知，纯化后覆盆子多酚的DPPH·清除率、对黄嘌呤氧化酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性较覆盆子多酚粗提物均显著提高(P < 0.05)，可见覆盆子多酚具备潜在的抗氧化、高尿酸、高血糖生物功效。
Table 8. Bioactivity of raspberry polyphenols
表8. 覆盆子多酚的生物活性
|
纯度/% |
DPPH·清除率IC50/μg/mL |
黄嘌呤氧化酶抑制活性IC50/μg/mL |
α-葡萄糖苷酶抑制 活性IC50/μg/mL |
纯化前覆盆子多酚 |
23.81 ± 1.75a |
109.30 ± 0.25a |
415.08 ± 17.13a |
15.02 ± 0.28a |
纯化后覆盆子多酚 |
68.58 ± 0.60b |
59.09 ± 0.42b |
97.71 ± 2.75b |
3.98 ± 0.43b |
维生素C |
|
13.25 ± 0.16c |
|
|
别嘌醇 |
|
|
2.11 ± 0.07c |
|
阿卡波糖 |
|
|
|
0.02 ± 0.00c |
注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05)。
3.7. 分子对接
鞣花酸与黄嘌呤氧化酶的结合能为−7.3 kcal/mol，与α-葡萄糖苷酶的结合能为−7.2 kcal/mol，说明鞣花酸能与这两种降尿酸、降血糖的关键靶点自发结合。
鞣花酸与黄嘌呤氧化酶分子对接结果如图7所示，鞣花酸主要通过氢键与Thr-1083、Ser-1082、Gln-767和Gln-1194连接，通过π键与Gln-1040和Met-1038相连，可见鞣花酸与黄嘌呤氧化酶之间存在较强的分子作用力；鞣花酸与α-葡萄糖苷酶分子对接结果如图8所示，鞣花酸与Arg-315、Asp-307以氢键相连，与Phe-303、Arg-315以π键相连，与Tyr-158、Phe-159、Phe-178、Arg-442、Glu-277、Asp-352、Gln-353、Asn-350、Thr-306以范德华力结合，说明鞣花酸与α-葡萄糖苷酶结合良好。
4. 讨论
本试验筛选出AB-8大孔树脂作为吸附覆盆子多酚的最佳大孔树脂，其吸附覆盆子多酚的过程符合准二阶动力学模型。大量研究表明，大孔树脂吸附蓝莓多酚[22]、樟树籽多酚[23]、马鞭草多酚[24]等植物多酚的过程都符合准二级动力学模型，与本研究的结果一致，说明二阶动力模型可能更适合用于解释大孔树脂吸附植物多酚的过程。本试验的富集工艺高效，制备的覆盆子多酚纯度从23.81% ± 1.75%上升到68.58% ± 0.60%，富集效果与钟等的工艺[9]相比有了明显提升；避免了使用大量酸性溶解调节吸附液pH的过程，在工业生产中，该工艺相比于目前已经报道的覆盆子多酚富集工艺更加简单，也更环保。综上，本工艺可为覆盆子多酚的富集研究提供理论基础。
Figure 7. Ellagic acid docked with xanthine oxidase molecules
图7. 鞣花酸与黄嘌呤氧化酶分子对接
Figure 8. Ellagic acid is molecular-docked with α-glucosidase
图8. 鞣花酸与α-葡萄糖苷酶分子对接
富集前、后覆盆子多酚的生物活性之间差异显著(P < 0.05)，富集后覆盆子多酚较覆盆子多酚粗提物对DPPH·清除能力、黄嘌呤氧化酶活性和α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力有了明显提升，说明覆盆子中发挥生物活性的主要功效成分是多酚类物质。其次，分子对接结果表明，覆盆子与靶点之间有较好的结合能力，进一步证实覆盆子可与降尿酸、降血糖的关键靶点相互作用，覆盆子具备潜在的抗高尿酸、高血糖功效。此外，该工艺制备的覆盆子多酚比绿豆、山药多酚对DPPH·清除力更高[25] [26]，比大蒜[27]、苦瓜[28]对α-葡萄糖苷酶的抑制活性更好，比芙蓉李[29]对黄嘌呤氧化酶抑制活性更优，说明覆盆子多酚在抗氧化、降血糖、降尿酸等方面具有较好的生物活性，这提示了覆盆子多酚作为药食两用保健食品的巨大前景。
展望未来，研究者可以进一步研究多酚富集的方法，挖掘药食两用植物的功效成分，制备高纯度的天然代谢类疾病靶点酶抑制剂，并深入探讨其作用机理，以期提高药食两用植物的经济效应和资源利用率，也能更好地防控疾病、为人类健康做出贡献。
基金项目
浙江省公益技术研究项目(LGN20C160005)。
NOTES
*通讯作者。