1. 引言
随着气候变化，全球干旱面积呈上升趋势[1]。中国是受干旱灾害影响较为严重的国家。据统计，在过去60年里，中国气象干旱地区以每年6.6%的速度增长[2]。呼伦贝尔草原位于内蒙古自治区东北部，总面积约10万km2，被誉为“牧草王国”，且“十年九旱”，干旱问题十分普遍[3]。其中，新巴尔虎左旗和新巴尔虎右旗发生严重和极端干旱的次数尤为频繁，满洲里市、额尔古纳市和新巴尔虎右旗的干旱趋势率也显著上升[4]。因此，在干旱不断加剧的情况下，筛选培育适应能力强的耐旱植物意义重大。
金莲花(Trollius chinensis Bunge)为毛茛科金莲花属的多年生草本植物，具有很高的药用和观赏价值[5]。主要分布在内蒙古、山西、东北等干旱地区。金莲花含有黄酮类、酚酸类、生物碱类等成分，能用于抗氧化、抑菌、抗炎。其中黄酮类化合物(荭草苷和牡荆素)的含量是评价金莲花药材品质的重要标准。目前多以中成药形式治疗咽炎、上呼吸道感染等疾病[6]。干旱条件对金莲花的种子萌发、生长发育及药用价值均会产生影响。石慧勤[7]用PEG溶液模拟干旱，研究了干旱对金莲花种子萌发的影响，发现当PEG溶液浓度为0~6%时，金莲花种子的萌发率呈下降趋势，当从6%增加到9%时，种子的萌发率开始逐渐增加，在9%时达到顶峰，表明一定浓度的干旱胁迫能刺激金莲花种子活性的提高。徐文艺[8]研究了干旱对金莲花幼苗的生理响应，发现影响程度由大到小为重度干旱 > 中度干旱 > 轻度干旱，而轻度干旱生理变化与对照差异不显著，表明轻度干旱不影响植物的生长。此外，同种植物因生态环境不同，其化学成分的种类和含量会产生差异。付秀[9]对11个不同产地的金莲花的化学成分进行研究时发现，内蒙古地区金莲花总生物碱含量相对较低，山西五台山金莲花总生物碱得率最高。孙慧娟[10]在研究来自大兴安岭和五台山地区的两种金莲花种子时发现，两个产地的种子生活力、萌发率以及荭草苷、牡荆素等药用活性成分均存在差异。然而，在目前的相关研究报道中，关于筛选不同地区优质金莲花种质资源的研究还处于空白状态，同时，深入探究不同程度干旱胁迫对金莲花成分的影响也成为了当前亟待解决的问题。
因此，本研究对根河市、阿尔山市、牙克石市、额尔古纳市、阿荣旗、陈巴尔虎旗等6个地区采集的金莲花种子进行种质资源筛选，并选取了优异种质进行了干旱胁迫处理。实验设置了四种不同程度的干旱处理：正常水分(CK，土壤含水率15%~20%)、轻度干旱(LD，土壤含水率12%~15%)、中度干旱(MD，土壤含水率5%~10%)、重度干旱(SD，土壤含水率5%以下)，并对金莲花的形态生长以及活性成分进行了全面深入的分析。这些研究结果将为抗旱金莲花品种的选育以及在干旱或半干旱地区的栽培提供有力的科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
本实验使用的植物材料为多年生草本植物金莲花(Trollius chinensis Bunge)的种子。采于呼伦贝尔根河市(GH)、阿尔山(AE)、牙克石市(YK)、额尔古纳市(EE)、阿荣旗(AR)、陈巴尔虎旗(CB)等6个地区(表1)。
Table 1. T. chinensis germplasm source and origin information
表1. 金莲花种质来源与产地信息
产区 |
海拔(m) |
年平均气温(℃) |
年平均降水量(mm) |
经度 |
纬度 |
GH |
714 |
−5.3 |
464.38 |
121˚31'E |
50˚47'N |
AE |
1003 |
−3.1 |
445.3 |
119˚57'E |
47˚11'N |
YK |
657 |
−4.0 |
388.5 |
120˚42'E |
49˚17'N |
EE |
570 |
−2.9 |
361.4 |
120˚10'E |
50˚14'N |
AR |
217 |
1.7 |
476.8 |
123˚28'E |
48˚08'N |
CB |
616 |
−2.9 |
330.1 |
119˚25'E |
49˚19'N |
注：GH：根河市；AE：阿尔山；YK：牙克石市；EE：额尔古纳市；AR：阿荣旗；CB：陈巴尔虎旗。
2.2. 实验方法
2.2.1. 6个产区金莲花种子资源的调查
于2023年7月初对6个产区的野生金莲花生长分布情况进行调查。设置12个1 m × 1 m的样方。详细记录每个样地内金莲花的株高和基径或丛径，同时计算所有样方内金莲花的盖度、Patrick丰富度指数和生物量(表2)。
Table 2. Growth of T. chinensis in six producing areas
表2. 6个产区金莲花生长情况
产区 |
平均株高(cm) |
平均基径或丛径(cm) |
盖度(%) |
Patrick丰富度指数 |
生物量(g/m2) |
GH |
76.63 |
1.81 |
8.5% |
68 |
171.68 |
AE |
72.88 |
1.62 |
5.3% |
43 |
106.71 |
YK |
83.75 |
1.85 |
5.7% |
23 |
69.64 |
EE |
84.13 |
1.50 |
7.6% |
61 |
166.10 |
AR |
91.00 |
1.80 |
6.7% |
20 |
66.15 |
CB |
60.00 |
1.15 |
2.5% |
5 |
15.26 |
注：GH：根河市；AE：阿尔山；YK：牙克石市；EE：额尔古纳市；AR：阿荣旗；CB：陈巴尔虎旗。
2.2.2. 6个产区金莲花种子千粒重的测定
2023年8月中旬对6个地区的金莲花的种子进行采集。采集后将种子带回东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室进行后续实验。按照我国《农作物种子检验规程其他项目检验》[11]中重量测定法，本试验采用千粒重测定方法，包括五百粒法和千粒法。五百粒法是从6个地区分别随机挑选金莲花种子，每个地区挑选的种子进行3个生物学重复，每次重复为500粒种子。千粒法同样进行3个生物学重复，每次重复是从6个地区分别随机挑选出1000粒种子。种子的变异系数不超过4.0，从而得出金莲花种子的千粒重。
2.2.3. 6个地区金莲花种子含水率的测定
从6个地区中分别称取2 g金莲花种子放入烘箱中100℃烘干48 h，取出测定干重，并计算含水率(%)。
含水率/% = (烘干前重量 − 烘干后重量)/烘干前重量 × 100%
2.2.4. 6个地区金莲花种子的萌发实验
金莲花种子的预处理参照段晓洁[12]的方法。用70%的酒精溶解赤霉素(GA3)，加蒸馏水，配制成浓度为550 mg/L的赤霉素溶液。在室温下用配制好的溶液浸泡种子12 h，置于铺有滤纸的培养皿中，25℃恒温培养，进行光照与黑暗各12 h的发芽试验。每个产地进行3个生物学重复，每个重复100粒种子。每天观察发芽情况，以种胚突破种皮为标准，观察15天，计算发芽率(%)。
发芽率/% = 已发芽种子数量/供试种子数量 × 100%
2.2.5. 金莲花干旱实验处理
将对来自6个不同地区的种子进行生物学特性分析，从中筛选出具有优异特性的种质。随后，把筛选出的优质金莲花种子均匀播撒在育苗盆中进行培育。育苗盆中的土壤为2份园土与1份沙土混合，温度控制为白天(24 ± 3)℃、夜间(16 ± 3)℃，光照时长16小时、黑暗时长8小时，相对湿度(30 ± 5)%，光照强度200 µmol/m2/s。在培养期间，每2天浇灌1次蒸馏水。待幼苗生长至30天，挑选长势一致且生长健壮的幼苗移至花盆中。当幼苗长至60天时，对其进行干旱胁迫处理，每个处理设置50盆苗。实验设置四种不同程度的干旱处理，分别为：对照(CK，土壤含水率15%~20%)、轻度干旱(LD，土壤含水率12%~15%)、中度干旱(MD，土壤含水率5%~10%)、重度干旱(SD，土壤含水率5%以下)。在干旱处理实施后的第7天，各处理下的幼苗植物形态存在明显差异，此时对所有处理的幼苗进行采收。
2.2.6. 金莲花幼苗测定指标与方法
金莲花在干旱处理后，植物形态存在明显差异。各处理组随机选取6株幼苗，测定了株高(从基部到顶端生长点)、根长(主根)、植物鲜重和植物干重、含水率等形态生长指标。于晴天上午9:00到11:00，采用Li-6400型便携式光合系统分析仪(LI-COR Inc.USA)对不同处理下的金莲花气体交换参数进行测定。采用二甲基亚砜法测定叶绿素含量[13]，称取金莲花叶片0.1 g，放入提前准备好的5 ml二甲基亚砜(分析纯)溶液中，在60℃恒温水浴条件下避光浸提实验材料2 h，直至叶片无色，收集上清液待测，每种处理进行3个生物学重复。以空白二甲基亚砜溶液作对照，紫外分光光度计测定吸光度(A)值，检测波长为665、649和480 nm，计算公式为：
Chla = (12.19A − 665 − 3.45A − 649) × V/1000S
Chlb = (21.99A − 649 − 5.32A − 665) × V/1000S
Car = (1000A − 480 − 2.14Chla − 70.16Chlb)/220 × V/1000S
V为提取液体积(ml)，m为叶片鲜重(g)。
2.2.7. HPLC测定金莲花幼苗中荭草苷和牡荆素的含量
本实验参考蔡红业[14]的方法并有所修改，采用(Wufeng LC-100, Wufeng Technologies, China)进行药用活性成分分析。荭草苷、牡荆素色谱条件为以流动相0.1%甲酸溶液(A)：甲醇(B) (88:12, V:V)为梯度洗脱，检测波长340 nm，流速1 mL∙min−1，柱温30℃，进样量10 μL，每针分析完毕用初始流动相平衡5 min后进行下一个样品分析。
精密称取荭草苷、牡荆素各5 mg，分别加入到10 mL离心管中，加5 mL 70%甲醇溶液溶解，分别制成浓度为1 mg/mL荭草苷和牡荆素溶液。分别吸取标准品待测液1 mL，加入一定量的70%甲醇溶液，配制成浓度梯度为1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的溶液，进行HPLC分析。以对应成分峰面积Y对其质量浓度(mg∙mL−1)进行线性回归，得荭草苷、牡荆素的回归方程。
取干燥至恒重的金莲花地上和地下部分研磨成粉末，分别称取0.3 g，加入到50 mL离心管中，加入25 mL 70%甲醇溶液，超声提取1 h，取上清。上样前用0.45 μm有机滤膜进行过滤，作为样品溶液。每个处理进行3个生物学重复。
2.3. 数据分析
采用SPSS进行单因素方差分析，采用duncan多重比较检验，检验各指标的差异显著性(p < 0.05)。采用Origin对差异分析结果进行数据可视化。
3. 结果
3.1. 优异种质筛选
对呼伦贝尔6个地区的金莲花种子的生物学特性进行了研究(表3)。种子重量方面，五百粒重和千粒重均具有相同的趋势，具体为牙克石市 > 额尔古纳市 > 阿荣旗 > 根河市 > 阿尔山市 > 陈巴尔虎旗。牙克石和额尔古纳地区的种子质量显著高于其它地区。根河市的含水率最高，达到了6.29%，显著高于其它5个地区。种子萌发率是评价种质资源的关键指标。金莲花种子在第9天开始萌发。其中，根河市和牙克石市的萌发率显著高于其它地区，分别为89.33%和88.33%，萌发率较高。综合以上数据分析，根河市的金莲花种子质量最优。
Table 3. Biological characteristics of T. chinensis seeds from different origins
表3. 不同产地金莲花种子生物学特征
产地 |
五百粒重(g) |
千粒重(g) |
含水率(%) |
萌发率(%) |
GH |
0.45 ± 0.03 b |
0.89 ± 0.02 b |
6.29 ± 0.04 a |
89.33 ± 1.70 a |
AE |
0.43 ± 0.01 b |
0.86 ± 0.01 b |
6.13 ± 0.09 b |
88.33 ± 3.09 a |
YK |
0.51 ± 0.02 a |
1.02 ± 0.01 a |
5.55 ± 0.11 d |
82.33 ± 1.25 b |
EE |
0.50 ± 0.04 a |
0.99 ± 0.03 a |
5.86 ± 0.06 c |
86.67 ± 2.06 ab |
AR |
0.45 ± 0.01 b |
0.89 ± 0.01 b |
5.97 ± 0.07 c |
85.00 ± 1.41 ab |
CB |
0.43 ± 0.03 b |
0.86 ± 0.01 b |
5.64 ± 0.03 d |
82.67 ± 1.89 b |
注：GH：根河市；AE：阿尔山；YK：牙克石市；EE：额尔古纳市；AR：阿荣旗；CB：陈巴尔虎旗。不同字母表示不同地区之间存在显著的统计学差异(p < 0.05)。
3.2. 干旱对金莲花幼苗形态生长的影响
通过种质筛选，选出根河市金莲花种子进行干旱处理。经过干旱处理，金莲花各形态指标在不同干旱条件下出现显著差异(图1)。研究发现，LD和MD处理下，株高均出现显著增长，分别比CK增加20.47%和8.29%。然而，LD和MD的根长显著低于CK。SD的金莲花生长受到严重抑制。株高和根长均比CK显著下降了20.56%和12.53%。生物量方面，LD的鲜重和干重显著高于CK。但是金莲花的含水率与土壤含水率呈显著正相关性，随着干旱程度的加重，金莲花含水率不断降低。根冠比是研究土壤干旱的重要指标。经研究发现SD的金莲花根冠比CK增加40.51%，而SD和MD的变化并不显著(表4)。
Figure 1. Growth of T. chinensis under different drought treatments
图1. 不同干旱处理下金莲花生长状况
Table 4. Morphological and growth indexes of T. chinensis under different drought treatments
表4. 不同干旱处理金莲花形态生长指标
处理 |
株高(cm) |
根长(cm) |
鲜重(g) |
干重(g) |
根冠比 |
含水率(%) |
CK |
2.49 ± 0.19 ab |
6.15 ± 0.27 a |
0.10 ± 0.03 b |
0.02 ± 0.01 c |
0.32 ± 0.06 b |
76.57 ± 1.86 a |
LD |
3.00 ± 0.41 a |
5.41 ± 0.31 b |
0.11 ± 0.03 a |
0.03 ± 0.01 a |
0.27 ± 0.07 b |
71.60 ± 1.09 ab |
MD |
2.69 ± 0.18 ab |
5.61 ± 0.23 ab |
0.08 ± 0.04 c |
0.03 ± 0.01 b |
0.34 ± 0.07 b |
63.08 ± 5.60 b |
SD |
1.98 ± 0.25 b |
5.38 ± 0.25 b |
0.05 ± 0.03 c |
0.02 ± 0.01 c |
0.44 ± 0.18 a |
49.62 ± 5.58 c |
注：不同字母表示不同处理之间存在显著的统计学差异(p < 0.05)。
3.3. 干旱处理对金莲花幼苗光合参数的影响
3.3.1. 干旱处理对气体交换参数影响
除了SD的净光合速率(Pn)显著降低之外，其他处理组之间差异并不显著。蒸腾速率(Tr)的变化趋势与净光合速率呈显著正相关。气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)均随着干旱程度的加深而显著降低，SD与CK相比分别降低74.18%和70.43% (图2)。
注：不同字母表示不同处理之间存在显著的统计学差异(p < 0.05)。
Figure 2. Effects of different drought treatments on gas exchange parameters of T. chinensis
图2. 不同干旱处理对金莲花气体交换参数的影响
3.3.2. 干旱处理对叶绿素含量的影响
叶绿素a和叶绿素b的含量均与干旱程度呈显著负相关(表5)，总叶绿素含量也呈相同趋势。然而，LD的类胡萝卜素含量比CK增加了3.37%。叶绿素a/b分析显示，干旱处理下的比值均显著高于CK，其中LD比值最高，比CK高出7.99%。
Table 5. Effects of different drought treatments on chlorophyll content of T. chinensis
表5. 不同干旱处理对金莲花幼苗叶绿素含量的影响
处理 |
叶绿素a(mg/g) |
叶绿素b (mg/g) |
类胡萝卜素(mg/g) |
总叶绿素(mg/g) |
叶绿素a/b |
叶绿素a + b |
CK |
1.69 ± 0.20 a |
1.00 ± 0.17 a |
0.43 ± 0.02 a |
3.12 ± 0.37 a |
1.70 ± 0.08 b |
2.69 ± 0.35 a |
|
1.61 ± 0.02 a |
0.87 ± 0.02 ab |
0.45 ± 0.01 a |
2.92 ± 0.03 a |
1.84 ± 0.01 a |
2.48 ± 0.04 ab |
MD |
1.33 ± 0.02 b |
0.73 ± 0.01 bc |
0.37 ± 0.01 b |
2.43 ± 0.03 b |
1.82 ± 0.02 a |
2.06 ± 0.02 b |
SD |
0.96 ± 0.09 c |
0.55 ± 0.07 c |
0.28 ± 0.03 c |
1.78 ± 0.19 c |
1.75 ± 0.05 ab |
1.50 ± 0.15 c |
注：不同字母表示不同处理之间存在显著的统计学差异(p < 0.05)。
3.4. 干旱处理对金莲花活性成分的影响
在LD条件下，金莲花幼苗地上部分的荭草苷和牡荆素含量均达到最高值，分别比CK增加了2.77%和8.13%。随着干旱程度的进一步加剧，这两种成分的含量呈现出下降的趋势。同样地，金莲花幼苗地下部分的荭草苷和牡荆素含量也展现出与地上部分相似的变化趋势。在LD条件下，地下部分的荭草苷含量较CK增加了2.89%，而牡荆素含量则增加了3.75% (图3)。因此，可以得出结论，轻度干旱条件有利于提升金莲花幼苗中这两种药用成分的含量。
注：不同字母表示不同处理之间存在显著的统计学差异(p < 0.05)。
Figure 3. Contents of medicinal components of T. chinensis under different drought treatment
图3. 不同干旱处理金莲花药用成分含量
4. 讨论
4.1. 金莲花优质种质的筛选
种子萌发是植物生活史中重要阶段之一，而种子的萌发率是评价种子萌发能力大小的关键指标[15]。本研究的6个采集样地均位于呼伦贝尔地区，该地区属于干旱和半干旱地区，水分条件在调节种子萌发过程中起支配作用，是决定幼苗能否存活的限制性因子[16]。研究发现，在这6个地区中，根河市的年降水量相对较多，水资源相对丰富，因此该地区的种子成熟度相对较高，同时研究结果也表明根河市采集的种子萌发率最高。此外，在野外采集过程中，金莲花在根河市的分布范围最广。
4.2. 金莲花应对干旱胁迫的形态生长和光合特性响应
形态指标直观地反应植物对干旱胁迫的响应。轻度干旱胁迫下的株高最高，中度干旱也出现增长，但在重度干旱受到严重抑制，说明适度的干旱有助于金莲花的生长。这与沙枣的研究相似[17]，沙枣在轻度干旱条件下未出现显著变化，但随着干旱程度的增加，各项形态指标出现明显变化。干旱处理下的金莲花根长显著降低，除轻度干旱之外根冠比均增大。祁心[18]在对北苍术的研究中也得出相同的结论。根系作为植物吸收水分的主要器官，根冠比的增大有助于金莲花吸收更多水分，缓解干旱胁迫对金莲花的伤害，提高抗旱性。
光合作用是植物生长发育的基础，是几乎所有生物能量循环的基础。叶片光合速率变化的原因一般分为气孔因素和非气孔因素[19]。由于气孔因素的影响，Gs和Ci具有相同的变化趋势。反之，Gs的变化与Ci的变化无明显相关性，则为非气孔因素。在本研究中发现Gs与Ci之间存在显著的正相关关系，因此可以推断，金莲花的光合速率主要受气孔因素影响。在干旱胁迫条件下，叶片气孔关闭以减少水分丧失，进而导致净光合速率降低。此外，叶片色素在植物生长发育中起重要作用，其含量的高低可以用来反映植物受胁迫的程度[20]。本研究发现在中度和重度干旱条件下，Chla、Chlb均显著下降。这表明干旱胁迫打破叶绿素合成与降解之间的动态平衡，从而导致叶绿素含量减少[21]。
4.3. 金莲花应对干旱胁迫的药用活性物质积累响应
荭草苷和牡荆素是金莲花的消炎作用的主要药用活性成分。本研究在金莲花地上和地下部分均检测出两种药用成分。在遭遇干旱等逆境胁迫时，药用植物会分泌大量的次生代谢产物[22]。例如：中度干旱胁迫下的钩藤幼苗[23]中钩藤碱与异钩藤碱含量显著积累；中度干旱胁迫下同样促进了菘蓝[24]中靛蓝含量的积累。本实验研究发现，轻度干旱胁迫促进了两种物质的积累，说明轻度干旱对提高金莲花品质有益。但是，中度和重度干旱条件下，药用成分含量显著下降，这与黄芪的研究相似，轻度干旱下黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量显著高于对照组，而中度、重度干旱显著降低[25]。因此，提高金莲花的药材品质需要适度的干旱胁迫。
5. 结论
6个产区金莲花种子在千粒重、含水率和萌发率等指标存在显著差异。其中根河市的种子萌发率达到了89.33%，显著高于其他处理组。综合其他指标，根河市的种质最为优质。进一步对优质种质栽培进行干旱胁迫，结果发现，与CK相比，在LD和MD处理下，金莲花株高分别增加了20.47%和8.29%，生长优势显著。但随着干旱程度加深，金莲花光合色素减少，光合效率显著下降。同时株高和根长分别降低了20.56%和12.53%，金莲花生长受到明显抑制。除此之外，LD处理促进了金莲花中荭草苷和牡荆素两种黄酮类成分的积累，显著提高了金莲花的药用活性成分。综合分析表明，金莲花具备一定的抗旱能力，轻度干旱有利于金莲花形态生长以及药用品质的提升。