1. 前言
人口老龄化问题日益凸显，关于衰老的相关研究越来越备受重视。衰老是随年龄增长而产生的一系列生理学和形态学方面的变化，是一个复杂的生理退化过程。随着个体年龄的增长，细胞、组织和器官会发生退行性变化，从而引起退行性疾病的发生，最终导致衰老相关疾病的发展和生命的终结[1]。如何延缓衰老是当代面临的一大挑战。在临床上，主要采取药物抗衰老，因为长期给药会引起副作用。因此，亟需寻找更安全、更有效的延缓衰老新方法。随着科学技术的发展，分子靶向干扰可能成为延缓衰老的热点。
近年来，相关研究阐明了CPE在神经系统中的重要性[2]。阿尔兹海默病(AD)就是一种与衰老相关的神经退行性疾病，也是老年人痴呆的主要原因[3]。既往研究表明，CPE与AD之间存在联系，它显示了CPE在不同大脑区域(包括新皮层和海马体)的人类AD斑块中的异常积累；在此基础上发现，阿尔茨海默病患者的CPE基因发生了新的突变，且这种突变与阿尔茨海默病相关的神经变性、记忆缺陷和抑郁症有关[4]。此外，CPE还保护CA3海马神经元免受压力引起的死亡和认知功能障碍[5]。目前国内外关于CPE的研究大多数局限于神经肽和肽激素的生物合成相关研究领域，而CPE抗衰老相关研究报道较少。
在本研究中，我们通过慢病毒转染shRNA建立CPE敲低模型，检测敲降CPE年轻(Y)细胞和过表达CPE衰老(O)细胞的衰老标志物蛋白和mRNA表达水平、细胞衰老水平和细胞活性。本项目的开展有助于更深入地了解CPE与细胞衰老的相关，明确CPE的抗衰老作用，为研究CPE作为潜在衰老标志物和抗衰老靶点提供理论基础。
2. 材料和方法
2.1. 细胞培养和处理
2.1.1. 细胞培养
293T细胞购自ATCC (Manassas, VA, USA)。在Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)中(Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA)添加10%胎牛血清(Thermo Fisher scientific)和青霉素(100 μg·mL−1)-链霉素(100 μg·mL−1, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，细胞在37℃的5% CO2培养箱中培养。原代正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)来源于接受手术清创的健康人供体(5~20岁)分离的人包皮。连续传代NHSF，将的NHSFS < 10代的定义为年轻(N1)细胞，将15代 < NHSFs < 25代的定义为中间(N2)细胞，将NHSFs > 40代的定义为衰老(N3)细胞。为了建立早衰模型，我们分别用UVA和H2O2处理细胞使其衰老。为了防止UVA被培养基中的因子吸收，在UVA照射前，将培养基完全抽吸，将NHSF浸入一层磷酸盐缓冲盐水中。然后，UVA治疗仪采用LK20W/09管(发射光谱320~400 nm)；采用Sigma-Aldrich法照射细胞3次，剂量为10 jcm−2/天，连续3天。距离源管300毫米的距离用于校准能量产量。NHSF在添加200 μm H2O2的DMEM中培养2 h (37℃，5% CO2)。细胞用无血清培养基洗涤两次后，在DMEM中培养4天。
2.1.2. CPE的慢病毒转染
293T细胞以1 × 10个/孔的密度接种于6孔板。pGL4.1- CPE载体2 ml，pGL4.1空载体，CPE-shRNA (shRNA#1: F: CCGGCTCCAGGCTATCTGGCAATAACTCGAGTTATTGCCAGATAGCCTGGAGTTTTTG, R: AATTCAAAAACTCCAGGCTATCTGGCAATAACTCGAGTTATTGCCAGATAGCCTGGAG or shRNA#2: F: CCGGATGCAATATTCCTGGTATTATCTCGAGATAATACCAGGAATATTGCATTTTTG, R: AATTCAAAAAATGCAATATTCCTGGTATTATCTCGAGATAATACCAGGAATATTGCAT)。
将control-shRNA (终浓度均为20 nM，GeneChem Company，China)加入293T细胞中，构建CPE-shRNA慢病毒。48 h后，离心收集上清，继续感染NHSF 2天。用400 ng·mL−1 puromycin筛选NHSF 2周，获得CPE稳定敲除的细胞株。
2.2. 定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)
TRIzol试剂(Ambion, USA)提取总RNA。使用RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(加拿大Fermentas公司)将RNA反向转化为cDNA，并使用Real-Time PCR Assay Kit (Thermo Scientific公司，美国)和CFX96 Touch实时系统(Bio-Rad公司，美国)进行定量。以GAPDH作为内参对照基因，检测IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β的基因表达(引物列表见表1)。
Table 1. The primers were sequenced by Real-Time PCR
表1. 引物序列采用Real-Time PCR
基因名称 |
正向引物 |
反向引物 |
IL-1 |
TGGTAGTAGCAACCAACGGGA |
ACTTTGATTGAGGGCGTCATTC |
IL-6 |
GGCCCTTGCTTTCTCTTCG |
ATAATAAAGTTTTGATTATGT |
IL-8 |
TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA |
AACCCTCTGCACCCAGTTTTC |
TNF-α |
CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG |
ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC |
TGF-β |
CTAATGGTGGAAACCCACAACG |
TATCGCCAGGAATTGTTGCTG |
GAPDH |
GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT |
GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
2.3. 免疫印迹
蛋白质印迹处理过的细胞在含有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldric, USA)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国)中于4℃裂解30 min。用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，并转移到PVDF膜(Millipore, MA, USA)上。PVDF膜用补充有5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭，然后与Anti-p53抗体、Anti-p21抗体(Abcam, Cam, UK)、Anti-p16抗体(SAB, USA)过夜培养-CPE抗体(Invitrogen, USA)，抗-GAPDH抗体(Invitrogen, USA)。然后将膜与第二抗体(Cell Signaling Technology, USA)孵育。利用Image J软件查看和分析蛋白质印迹图像。
2.4. 衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)
具体方法参照β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)说明书。显微镜拍照，重复3次以上实验。
2.5. CCK-8检测细胞增殖能力
具体方法参照CCK-8试剂盒(Invitrogen, USA)说明书。按试剂盒说明书测得各孔吸光度值并计算细胞活性，重复3次以上实验。
2.6. 数据统计
使用wilcox.text对细胞转录组数据进行差异表达分析。体外实验采用graphpad prism version 8.0.0进行统计分析。所有数据显示为三个独立实验的平均值 ± SEM。两组间比较采用Student’s t- test检验，p < 0.05为差异有统计学意义的水平。
3. 结果
3.1. CPE的表达
为验证CPE的表达与衰老的相关性，我们检测了年轻、中等和衰老NHSFs中CPE的表达水平。图1(A)显示衰老NHSFs中CPE的mRNA水平显著降低。随后，我们通过UVA照射和过氧化氢刺激建立了细胞衰老模型。结果显示，与对照组相比，UVA照射和过氧化氢诱导的NHSFs中CPE的mRNA水平显著降低(图1(B)，图1(C))。结果表明，CPE在年轻代NHSFs表达高，提示CPE是一个潜在是衰老标志物。
Figure 1. Expression levels of CPE mRNA in different passage cells (A), H2O2 (B) and UVA (C). Control group vs Experimental group, *p < 0.05, 0.01 < **p < 0.05, ***p < 0.01
图1. CPE mRNA在不同传代细胞(A)、H2O2 (B)和UVA (C)处理下的表达水平。对照组vs实验组，*p < 0.05，0.01 < **p < 0.05，***p < 0.01
3.2. CPE敲低与NHSFs衰老的相关性
为了评估CPE敲低对的NHSFs影响，我们通过shRNA建立了CPE敲低模型。如图2(A)和图2(B)所示，我们通过qRT-PCR和western blotting检测CPE敲低效率的质量。结果表明，CPE敲低模型构建成功。然后，我们检测NHSFs的增殖和SA-β-gal染色。与对照组细胞系相比，CPE敲低细胞系的细胞活性显著降低(图2(C))，而CPE敲低细胞系的SA-β-gal细胞活性显著升高(图2(D))。
Figure 2. Senescence of NHSFs induced by CPE silencing. mRNA expression level (A) and protein level (B) of CPE gene knockout in NHSFs; CCK-8 assay revealed the effect of silenced CPE on cell proliferation (C); SA-β-gal staining (D). Control group vs Experimental group, *p < 0.05, 0.01 < **p < 0.05, ***p < 0.01
图2. CPE沉默诱导NHSFs的衰老。NHSFs中敲除CPE基因中CPE的mRNA表达水平(A)和蛋白水平(B)；CCK-8测定揭示了沉默的CPE对细胞增殖的影响(C)；SA-β-gal染色(D)。对照组vs实验组，*p < 0.05，0.01 < **p < 0.05，***p < 0.01
3.3. CPE敲低与炎症的相关性
此外，我们采用qRT-PCR方法检测炎症因子mRNA (IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β)的表达。结果显示，在CPE敲低组中，这些炎症相关基因的表达均增加(图3)。提示CPE基因敲低可引起细胞衰老和炎症反应。
Figure 3. mRNA levels of inflammation-related genes in CPE-silenced NHSFs. Control group vs Experimental group, *p < 0.05, 0.01 < **p < 0.05, ***p < 0.01
图3. CPE沉默的NHSFs中炎症相关基因的mRNA水平。对照组vs实验组，*p < 0.05，0.01 < **p < 0.05，***p < 0.01
4. 结论与展望
本研究在敲降CPE分子后利用WB、qRT-PCR、衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)，CCK8等实验测定细胞衰老程度，结果表明，敲降CPE分子后，NHSF细胞炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β mRNA表达程度发生改变，细胞衰老程度加深，细胞活性减弱，由此我们得出结论，CPE分子作为潜在的细胞衰老标志物可以抑制细胞的衰老。但本实验只局限于验证了CPE分子对于细胞衰老的作用，后期我们将会开展细胞生物学，分子生物学，生物信息学，基因组学等方面的研究，更加系统地深入探究CPE分子的抗衰老及相关疾病治疗的分子机制。为CPE分子的开发提供科学的理论帮助。
基金项目
2023年度湖南省大学生创新训练计划(4350)；2024年度湖南省大学生创新训练计划(5921)湖南省教育厅自然科学研究项目(23A0727)湖南省自然科学区域联合基金项目(2024JJ7337)。
NOTES
*通讯作者。