1. 引言

镰刀菌根腐病是烟草的重要土传根茎病害，对烟草的产量和质量构成严重威胁。该病害由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀菌(F. solani)引起，其病害症状通常表现为根部变褐、腐烂，最终导致植株萎蔫、枯死[1]。镰刀菌可单独侵染，也可与其他病原菌如黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)和青枯病菌(Ralstonia solanacearum)共同侵染，进一步加剧病害严重程度[2]。这种病害的广泛发生不仅严重影响烟叶的商品价值，还可能导致全田绝收。

当前，对镰刀菌根腐病的主要防治策略包括抗病品种的选育和化学药剂的使用。然而，抗病种质资源的匮乏以及抗病品种选育周期的漫长限制了这一方法的广泛应用[3]。另一方面，化学防治虽然在短期内能够有效控制病害，但长期大量使用化学药剂会带来环境污染、农药残留等问题，并加速病原菌产生抗药性，最终导致病菌群体的遗传结构发生生理分化和变异[4]，进一步增加病害防治的难度。随着绿色农业理念的推广，开发生态友好型的生物防治剂逐渐成为镰刀菌病害防治的重要方向。近年来，针对根腐病的生物防治研究主要集中在木霉菌(Trichoderma spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)。姚晨虓等[5]筛选出棘孢木霉Tr-0111，对烟草镰刀菌的抑制率达到93.13%，并能促进烟草种子的萌发和根系的生长；何明川等[6]分离到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) MC4-2对烟草黑胫病的盆栽防效达到63.86%；许乐等[7]获得的内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) DS-R5通过抑制腐皮镰刀菌孢子萌发，破坏菌丝结构和内部细胞器抑制病原菌生长，对丹参根腐病的盆栽防效达到61.4%。然而，目前针对烟草镰刀菌根腐病的生防细菌研究尚不系统，对其作用机制的揭示也较为有限。因此，本研究从健康烟株根际土壤中筛选拮抗细菌菌株，获得对烟草镰刀菌根腐病主要病原具有较好抑制作用的拮抗细菌菌株，明确其种类，并测定其防效及对烟草的促生效果，为烟草镰刀菌根腐病高效生物防治剂的开发提供重要的微生物资源和理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

供试细菌：20株细菌菌株，分离自湖北省烟区烟草根际土壤，保存于湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室。

供试烟草品种：云烟87，由湖北省烟草科学研究院提供。

供试病原菌：烟草镰刀菌根腐病菌(F.oxysporum),该病菌经致病性测定和鉴定，保存于湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室。

供试培养基：LB培养基：氯化钠10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，1000 mL水，琼脂15 g，灭菌；TSA培养基：胰酪蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉15 g，1000 mL水，pH值7.3 ± 0.2，灭菌；NA培养基：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，蒸馏水补足1000 mL，pH 7.2，灭菌；PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15~20 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.4，灭菌。生理生化所需培养基均购买自北京酷莱博科技有限公司，按照使用说明书配制并灭菌。

2.2. 拮抗细菌的分离和筛选

菌株分离：土壤采自湖北省襄阳市主要烟区烟田中的健康烟草植株根际。采土时，用铁铲挖开烟草根部土壤，深度为10~15 cm，在不损伤烟草根系的情况下，采集烟株根际土壤。取10 g带根土壤加入有90 mL无菌水的锥形瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中，200 r/min振荡1 h，使待测土样充分稀释均匀，取出后静置沉淀10 min，取上清液依次稀释至10⁻¹~10⁻⁶倍，吸取100 μL在LB平板上涂布。37℃培养箱中培养24 h，选择不同形态菌株多次平板培养和纯化，直到获得纯化的单菌落，甘油保存。

菌株筛选：以烟草根腐病尖孢镰刀菌(F.oxysporum)为指示菌，采用平板对峙法测定待测菌株对尖孢镰刀菌的拮抗活性。在PAD平板上预先活化尖孢镰刀菌，用直径为5 mm的无菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于新的PDA平板中央，在距离平板中心2.5 cm处上下平行划线接种分离纯化得到的不同细菌。以只接种病原菌为空白对照。每处理设3次重复，将平板置于28℃恒温箱内培养5 d后观察病菌生长情况。记录抑菌带宽度，筛选出抑菌带宽度大于5 mm的菌株进行复筛。将初筛获得的细菌用于复筛，复筛方法同上，但每个平板两侧接种同一个菌株，对照不接菌且长满平板后记录菌株的抑菌带宽度。将上述初筛平板取出，测量抑菌带宽度并计算抑菌率，计算公式如下：

$抑菌率=\left[\left(对照组抑菌带宽度-处理组抑菌带宽度\right)/对照组抑菌带宽度\right]\times 100\text{\%}$ (1)

2.3. 拮抗细菌的鉴定

2.3.1. 形态观察和生理生化特征

接种拮抗菌在LB液体培养基中过夜培养，使用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上将筛选出的拮抗细菌进行划线，置于28℃培养24 h，观察菌落形态特征，使用革兰氏染色试剂盒对拮抗细菌进行革兰氏染色，观察染色结果。参照文献[8] [9]的方法对菌株进行生理生化测定。将5 μL菌液分别滴在产铁载体、解磷、解钾、固氮、蛋白酶、淀粉酶及明胶培养基上，在28℃下静置培养6 d，根据是否产生透明圈来判断是否具有该项活性。吲哚试验使用蛋白胨水培养基，将10 μL菌液接种于10 mL蛋白胨水培养基中28℃培养48 h。培养结束后取1 mL培养液于1.5 mL离心管中，沿管壁缓缓加入40 μL kovac氏试剂，静置观察现象。细菌若含有色氨酸酶，则分解蛋白胨中色氨酸形成吲哚，加入kovac氏试剂后与吲哚发生反应，形成红色分层。每组实验3个重复。

2.3.2. 菌株的分子学鉴定

提取细菌基因组参见谢永丽等[10]方法。利用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'对其16S rRNA基因进行PCR扩增后测序，将16S rRNA的PCR扩增产物回收纯化后由武汉擎科生物科技有限公司测序。测序结果提交NCBI数据库进行BLAST同源性分析，再利用MEGA11.0软件进行序列比对以及系统进化树的构建[11] [12]。

2.4. 拮抗细菌纤维素酶和几丁质酶活性的测定

菌株培养48 h，收集发酵液的上清液(全菌液经12000 r/min离心5 min，取上清液过滤)。几丁质酶与纤维素酶活性分别使用维素酶活性检测试剂盒(上海原鑫生物，YX-SH-TQ22025)与几丁质酶活性检测试剂盒(上海原鑫生物，YX-W-B917)进行检测[13]。

2.5. 拮抗细菌发酵液对烟叶防御酶活性诱导试验

选取长势大小一致的烟苗，在烟苗移栽后7 d进行灌施拮抗细菌发酵液(1.0 × 10⁸ cfu/mL) 40 mL，以清水处理为对照(CK)，各处理6株，重复3次。处理7 d后取第3片叶，采用邻苯二酚法测定多酚氧化酶(PPO)活性[14]，愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性[15]，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参考文献[16]的方法。

2.6. 拮抗细菌对烟草根腐病盆栽防效的测定

试验设计空白组CK、对照组T1、处理组T2。尖孢镰刀菌接种于PDB液体培养基，28℃、200 r/min振荡培养7 d，制成孢子浓度为1.0 × 10⁸ cfu/mL的孢子悬液；拮抗细菌接种于LB液体培养基，37℃、200 r/min振荡培养48 h，制成浓度为1.0 × 10⁸ cfu/mL的细胞悬液。选取长势一致的烟草，移栽7 d后采用灌根法浇灌植株，每株灌施病原菌孢子悬液200 mL。对照组T1在7 d后进行甲霜·锰锌可湿性粉剂(有效成分含量为58%，其中甲霜灵10%，代森锰锌48%，苏州宝灵化工股份有限公司) 600倍溶液浇灌处理。处理组T2在7 d后每株灌施拮抗细菌发酵液200 mL。CK灌施清水做空白处理。每个处理6株，设3个重复。于最后一次灌根后15 d开始调查发病情况。参照标准GB/T23222-2008 [17]方法进行烟草根腐病病情指数分级。计算发病率、病情指数和相对防效。

$发病率=\frac{染病株数}{调查总株数}\times 100\text{\%}$ (2)

$病情指数={\displaystyle \sum \left(各级病株数\times 该病级值\right)/\left(调查总株数\times 最高级值\right)\times 100\text{\%}}$ (3)

$相对防效=\frac{对照病情指数–处理病情指数}{对照病情指数}\times 100\text{\%}$ (4)

3. 结果与分析

3.1. 拮抗菌株的筛选

将20株细菌与尖孢镰刀菌进行平板对峙试验，结果如表1。其中对尖孢镰刀菌具有高效拮抗作用(抑菌率 > 50%)的拮抗细菌7株，从中选择抑菌率为86.3%的TH0008菌株进一步测定并验证其抑菌效果，平板抑菌如图1。

Table 1. The antagonistic effect of bacteria on F. oxysporum

表1. 细菌对尖孢镰刀菌抑菌效果

Figure 1. Antagonistic effect of antagonistic strain TH0008 on F. oxysporum

图1. 拮抗菌株TH0008对尖孢镰刀菌的拮抗效果

3.2. 拮抗菌株TH0008的鉴定

3.2.1. 形态观察和生理生化特征

图2显示，菌株TH0008为革兰氏染色阳性，在TSA培养基上28℃黑暗培养24 h，菌落表面皱缩，近圆形，扁平，呈乳白色不透明。其生理生化特征见表2，菌株TH0008能够固氮，分解有机磷和无机磷以及产蛋白酶。

Table 2. Physiological and biochemical characteristics of strain TH0008

表2. 菌株TH0008的生理生化特性

Figure 2. Colony (a) and cell morphologies (b) of antagonistic strain TH0008

图2. 拮抗菌株TH0008菌落形态(a)与细胞形态(b)

3.2.2. 分子生物学鉴定

将拮抗菌株TH0008的16SrRNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，利用MEGA11.0构建系统发育进化树。结果如图3所示，菌株TH0008与Bacillus altitudinis (ASJC01000029)聚类为同一分支，同源性达到100%。结合系统发育分析，鉴定TH0008为芽孢杆菌属的高地芽胞杆菌。

3.3. 拮抗菌株TH0008纤维素酶和几丁质酶活性的测定

许多生防微生物可以分泌几丁质酶和纤维素酶，破坏植物病原真菌细胞壁的结构，影响其稳定性因而表现出有较强的抑菌作用[18]。在菌株TH0008的发酵上清液中检测到了几丁质酶和纤维素酶活性，见图4，酶含量分别为112.74 U∙mL⁻¹和230.19 U∙mL⁻¹，表明该菌株能产生几丁质酶和纤维素酶，具有分解尖孢镰刀菌细胞壁中几丁质和纤维素的能力。

Figure 3. Phylogenetic tree of antagonistic strain TH0008

图3. 拮抗菌株TH0008的系统进化树

Figure 4. Contents of chitinase and cellulose in strain TH0008

图4. 菌株TH0008的几丁质酶和纤维素酶含量

3.3.1. 拮抗菌株TH0008发酵液对烟叶防御酶活性诱导试验

多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(POD)三种防御酶与植物的抗(耐)病性密切相关[19]。如图5所示，经过发酵液处理后的烟面，其叶片内三种防御酶活性与CK相比均有显著的提高。说明菌株TH0008发酵液处理可以诱导烟苗内多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(POD)三种防御酶活性的显著提高。

Figure 5. The effect of fermentation broth of strain TH0008 on PPO, POD, and PAL enzyme activities in tobacco leaves

图5. 菌株TH0008发酵液对烟叶PPO、POD和PAL酶活性的影响

3.3.2. 盆栽试验

如图6所示，CK处理发病率为85.7%，甲霜锰锌处理发病率为56.1%，TH0008处理烟草镰刀菌根腐病的发病率为14.0%；病情指数仍以CK处理最高，为48.3，甲霜锰锌和TH0008处理病情指数分别为28.6和8；甲霜锰锌和TH0008发酵液处理的盆栽相对防效为39.8%和84.9%，以TH0008处理相对防效更高。

Figure 6. Potting experiment on the control effect of strain TH0008 bacterial solution

图6. 菌株TH0008菌液的盆栽试验防效

4. 讨论

镰刀菌根腐病的主要致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀菌(Fusarium solani) [20]，不同生态区域的主要致病菌种类存在显著差异[21]。陈高航[22]在湖北恩施7个烟区采集的18个样本中，分离出接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、三线镰刀菌(F.tricinctum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，致病性分析发现，烟草镰刀菌根腐病的主要致病菌为尖孢镰刀菌，可导致烟草根部腐烂，而其他两种镰刀菌对烟草根部未表现出显著致病性。目前，针对烟草镰刀菌根腐病生物防治资源的研究较少。谯天敏等[23]研究表明，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) Y6对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌率为30.6%；李姝江等[24]筛选的蜡样芽孢杆菌B3对茄病镰刀菌(F.solani)的抑菌带直径为26.0 mm，盆栽防效为25.57%~97.56%；倪方方等[25]研究指出，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)对白术尖孢镰刀菌的平板对峙抑菌率为52.3%，盆栽防效36.33%；姚凤琴等[26]报道了枯草芽孢杆菌Bv17对茄病镰刀菌的平板抑菌率为85.44%，盆栽防效达70.52%~97.32%。芽孢杆菌可通过分泌抑菌物质、合成促生长激素及诱导系统抗性等机制显著提高植物抗病能力[27] [28]。

本研究中从健康烟草根际土壤中分离筛选出对尖孢镰刀菌(F. oxysporum)拮抗效果显著的菌株TH0008，其抑菌率为86.3%，对烟草根腐病盆栽防效为84.9%。根据菌株形态特征、生理生化特性以及16S rRNA分子鉴定，结合系统发育树分析，确定菌株TH0008为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。诱导抗性被认为是生物防治作物病害的重要机制之一，植物抗病性常通过抗性相关防御酶如PPO、POD和PAL的活性来衡量，这些酶在植物的新陈代谢及能量转化等生命活动中起关键作用。PPO和PAL是苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶，可直接调控酚酸的形成，从而防止病原菌繁殖扩散；POD是植物体内主要的活性氧清除剂，主要通过清除活性氧、合成木质素等方式，增强植物细胞壁的屏障作用[29]。本研究中接种菌株TH0008发酵液处理可以诱导烟苗内多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(POD)防御酶活性的表达，从而增强了烟草对根腐病的抗性。此外，生防细菌可通过分泌几丁质酶、纤维素酶等胞外水解酶，降解病原真菌细胞壁，导致病菌菌丝崩解[30]。本研究筛选的高地芽孢杆菌TH0008的发酵上清液中含有几丁质酶和纤维素酶，这可能是其对尖孢镰刀菌产生显著抑菌效果的主要机制之一。然而，其具体的作用机理及抗菌物质的种类和作用路径尚需进一步研究。

5. 结论

本研究从健康烟株根际土壤中筛选获得了对烟草镰刀菌根腐病防治效果显著的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)TH0008，对尖孢镰刀菌的抑菌率达86.3%；盆栽试验表明，该菌株可有效降低烟草尖孢镰刀菌根腐病的发病率和病情指数，盆栽防效达84.9%；进一步研究发现， TH0008发酵液中检测到了几丁质酶和纤维素酶，可溶解病原真菌的细胞壁，从而抑制尖孢镰刀菌的侵染能力；同时菌株发酵液显著诱导提高烟苗中PPO、POD和PAL等防御酶活性，促进烟株生长发育并增强烟株抗病性。本研究为烟草镰刀菌根腐病的生物防治提供了新的菌种资源，并为进一步探索其作用机理及田间应用潜力奠定了基础。

基金项目

品牌导向的优质雪茄烟叶均质化生产技术体系研究[110202101059(XJ-08)]；国产马杜罗茄衣烟叶生产技术研发与应用[110202201040(XJ-11)]。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献