1. 引言
山茶油为山茶属油茶树种籽经压榨或浸出提取得到的高营养价值的优质木本食用油，是中国南方和东南亚广泛使用的最受欢迎的食用油之一[1]。茶油中不饱和脂肪酸高达90%，其中油酸75%~83%，亚油酸7.4%~13%，茶油的脂肪酸组成与世界上公认的最好的木本食用植物油——橄榄油极为相似，因此，茶油被誉为“东方的橄榄油”[2]。山茶油中的多酚类化合物是油脂主要的天然抗氧化剂，所以多酚类物质对山茶油品质的保证有很大的作用[3]。
多酚类化合物是一类复杂的具有多个酚羟基的次生代谢产物，其分布非常广泛，如蔬菜、水果、花卉等[4]。具有去除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌等对人体十分有益的作用[5]。多酚类化合物是分子中具有多羟基化合物的总称，包括了低分子量的简单酚类到具有高聚合结构的大分子聚合物，多数情况下酚类化合物和单糖或多糖相结合，同时还以衍生物的形式存在，结构复杂[4]，山茶油中的多酚类化合物主要有儿茶素、没食子酸、阿魏酸等。本实验中主要研究山茶油中的没食子酸和阿魏酸。
没食子酸亦称“五倍子酸”、“棓酸”。没食子酸既可溶于水，也可溶于有机溶剂如乙醚或丙酮，这一特性使其成为非常合适的交联剂[6]。由于丁基-4-羟基苯甲醚有致癌性，国外大部分水产加工品都改用浸演或喷涂没食子酸作抗氧化剂[7]。李肖玲等[8]报道了没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性。
阿魏酸的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一。阿魏酸能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理机能[9]。近年来，有许多关于阿魏酸对感冒病毒(IV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)和艾滋病病毒(HIV)都有显著抑制作用的报道。其中阿魏酸对艾滋病病毒有抑制作用，从而存在阿魏酸成为未来化学治疗剂的可能[10]。
由于现在人的生活水平日益提高，注重自身的保养，对于食品的要求也越来越高，特别是食品的营养成分的含量。而油又是中国饮食当中不可缺少的，所以油的质量对于我们来说就显得十分重要。山茶油是一种具有高营养价值的油，茶油里面的多酚类物质，对于人体更有抗衰老、抗癌等奇效，所以市场价值比较高，由于这种利益的驱动下，有些商人就容易去伪造相应的营养成分含量。因此，需要一种方法来快速、简单、精确地测量其含量。
本研究通过建立液相色谱法测定山茶油中没食子酸和阿魏酸多酚类化合物，并成功用于各地山茶油测定，为评估山茶油的质量提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 试剂与仪器
2.1.1. 实验试剂
阿魏酸(≥99%)、没食子酸(≥95%)、冰乙酸(AR)、正己烷(AR)、甲醇(AR)购于阿拉丁试剂有限公司；乙腈(色谱纯)购于美国J.T.Baker公司；水为超纯水；六种不同产地山茶油购于联华超市股份有限公司。
2.1.2. 实验仪器与设备
高效液相色谱仪(P230II，大连伊利特有限公司)；紫外分光光度计(L6S，上海精密科学仪器有限公司)；电子天平(ME204E，瑞士苏黎世梅特勒–托利多公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DGG-9140A，上海森信实验仪器有限公司)；超声清洗器(KQ5200，昆山市超声仪器有限公司)；超纯水器(UPWS-1-60D)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 标准品的配制
分别称取阿魏酸和没食子酸两种标准品各0.5000 g，用纯水溶解定容至1000 mL容量瓶中，摇匀，作为标准品储备液，溶液浓度为0.5 mg/mL。吸取阿魏酸和没食子酸标准储备液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL，用去离子水定容至10.0 mL，配置相当于25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL浓度标准曲线，低温避光冷藏待用。
2.2.2. 油样中多酚类化合物的测定
准确称取山茶油样品20.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入50.0 mL正己烷充分振摇3 min，加入20.0 mL 60%甲醇充分振摇5 min，再于250 mL分液漏斗中静置20 min分液，向上层液体中加入20.0 mL 60%甲醇重复提取1次，合并两次的下层滤液，加甲醇定容至50.0 mL得试样溶液。再将试样溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。
2.2.3. 最佳检测波长的确定
为确定没食子酸和阿魏酸的最佳检测波长，使用紫外可见分光光度计对稀释得到的0.1 μg/mL的没食子酸和0.2 μg/mL的阿魏酸标准溶液进行190~600 nm波长扫描，得到各自的波长扫描图。
2.2.4. HPLC分析条件
色谱柱为ZORBAX SB-C18反相柱(4.6 mm × 150 mn, 5.0 μm)；DAD检测器，检测波长280 nm；柱温35℃；流量1.0 mL/min；进样量10 μL；流动相为0.5%乙酸(A) + 乙腈(B)；梯度洗脱顺序为0，100% A；0~4 min，100%~95% A，0~5% B；4~7 min，95%~80% A，5%~20% B；7~25 min，80%~30% A，20%~70% B；25~30 min，30%~0% A，70%~100% B；30~33 min，0%~100% A，100%~0% B。
3. 结果与分析
3.1. 最佳检测波长的确定
使用紫外可见分光光度计对0.1 μg/mL的没食子酸和0.2 μg/mL的阿魏酸标准溶液进行波长扫描，结果如图1所示。由图中可以看出，阿魏酸的紫外波长是215 nm和311 nm，没食子酸的紫外波长是212 nm和262 nm，因为用HPLC时候需要综合两个样品，由于阿魏酸最高的时候没食子酸很低，没食子酸最高的时候阿魏酸很低，所以在280 nm的时候阿魏酸和没食子酸都还可以，因此在用HPLC的时候用280 nm。
Figure 1. Uv full wavelength scan of ferulic acid and gallic acid
图1. 阿魏酸与没食子酸的紫外全波长扫描图
3.2. 线性关系与检出限考察
以没食子酸、阿魏酸的浓度C (μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性绘制，得到其方程为：没食子酸Y = 21.44X − 14.821 (R2 = 0.9993)；阿魏酸Y = 23.091X − 65.104 (R2 = 0.9992)；R值都在0.999以上，说明在该浓度范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系。将两标样最低浓度不断稀释进样，测得两化合物的检出限(LOD, S/N = 3)分别为0.2 μg/mL、0.6 μg/mL。没食子酸、阿魏酸标准品的色谱图如图2所示，阿魏酸的保留时间是15.2 min、没食子酸的保留时间是8.9 min。
Figure 2. Standard chromatogram of ferulic acid and gallic acid
图2. 阿魏酸和没食子酸标准色谱图
3.3. 精确度试验
分别将50 μg/mL阿魏酸、没食子酸的标准溶液连续重复进样5次，测得各组分的峰面积，计算其相对标准偏差(RSD)，结果如表1所示。其相对标准偏差均小于1%，说明其重现性好、精确度高。
Table 1. Result of precision of ferulic acid and gallic acid
表1. 阿魏酸、没食子酸精密度试验结果
化合物 |
浓度(μg/mL) |
平均值(μg/mL) |
相对标准偏差(RSD)/% |
没食子酸 |
48.00 |
48.83 |
48.12 |
48.41 |
48.22 |
48.32 |
0.76 |
阿魏酸 |
50.62 |
50.53 |
50.84 |
50.75 |
50.57 |
50.66 |
0.27 |
3.4. 日内精密度和日间精密度
取标准曲线制备项下100 μg/mL的没食子酸、阿魏酸标准溶液，于日内不同时间，每相隔2 h，分别在开机基线走平后的0、2、4、6、8 h进样分析，测定其日内精密度结果如表2所示。RSD均低于3%，表明其日内的精密度较好。
Table 2. Intraday precision of ferulic acid and gallic acid
表2. 阿魏酸、没食子酸日内精密度
化合物 |
浓度(μg/mL) |
平均值(μg/mL) |
相对标准偏差(RSD)/% |
阿魏酸 |
88.64 |
91.77 |
87.86 |
90.30 |
85.99 |
88.91 |
2.13 |
没食子酸 |
93.85 |
96.40 |
91.80 |
96.40 |
91.73 |
90.31 |
2.97 |
取标准曲线制备项下100 μg/mL的没食子酸、阿魏酸标准溶液，于日间同一时间，分别在开机基线走平后连续三日进样分析，测定其日间精密度结果如表3所示。RSD均低于4.5%，表明其日内的精密度较好。
Table 3. Intraday precision of ferulic acid and gallic acid
表3. 阿魏酸、没食子酸日内精密度
化合物 |
浓度(μg/mL) |
平均值(μg/mL) |
相对标准偏差(RSD)/% |
Day1 |
Day2 |
Day3 |
阿魏酸 |
89.89 |
98.96 |
95.68 |
94.98 |
4.20 |
没食子酸 |
93.96 |
98.60 |
102.40 |
98.40 |
3.84 |
3.5. 加标回收率试验
取样品5作为空白样品，进行加标回收试验。取3份分别加入如表4所示50%、100%和150%共3个水平的没食子酸和阿魏酸对照品，按照2.3色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表4。由表中可以看出，在山茶油中分别加入不同浓度的2种多酚类化合物，其平均回收率分别为96.94% (没食子酸)、92.56% (阿魏酸)，且相对标准偏差(RSD)均小于3%。
Table 4. Results of recovery test
表4. 加标回收试验结果
化合物 |
本地值μg |
加标量μg |
测得量μg |
回收率/% |
平均回收率/% |
相对标准偏差(RSD)/% |
没食子酸 |
62.88 |
30.23 |
92.49 |
98.06 |
96.94 |
1.60 |
62.88 |
60.52 |
120.46 |
95.17 |
62.88 |
90.41 |
151.09 |
97.58 |
阿魏酸 |
158.27 |
80.32 |
231.45 |
91.13 |
92.56 |
2.26 |
158.27 |
161.43 |
306.11 |
91.60 |
158.27 |
240.62 |
386.70 |
94.96 |
3.6. 实际样品分析
按所建立的方法对6种不同产地山茶油中没食子酸和阿魏酸的含量进行测定，结果如表5所示。从表中可以看出，因为没食子酸、阿魏酸的检出限分别为0.2 μg/mL，0.6 μg/mL。所以在6种样品中检测到了不同浓度的没食子酸、阿魏酸，1-湖南号中的没食子酸含量最高，2-江西号其次。阿魏酸含量最高的是2-江西号，但是阿魏酸6种山茶油中的含量都比较平均。
Table 5. Determination results of samples
表5. 样品测定结果
油样品产地及编号 |
1-湖南 |
2-江西 |
3-浙江 |
4-福建 |
5-广西 |
6-广东 |
没食子酸含量(μg/g) |
172.23 |
86.85 |
56.33 |
55.46 |
62.88 |
54.74 |
阿魏酸含量(μg/g) |
151.65 |
161.22 |
153.14 |
151.47 |
158.27 |
154.31 |
4. 结论
1) 通过紫外分光光度计对没食子酸、阿魏酸进行波长扫描，确定了采用高效液相色谱法(HPLC)测定山茶油中多酚类化合物含量的最佳检测波长为280 nm。
2) 采用HPLC法测定了山茶油中2种多酚类化合物的含量，建立了标准曲线。浓度范围为25~500 μg/mL的2种多酚类化合物(没食子酸、阿魏酸)都具有较好的线性关系，其方程为：没食子酸Y = 21.44X − 14.821 (R2 = 0.9993)；阿魏酸Y = 23.091X − 65.104 (R2 = 0.9992)，没食子酸、阿魏酸的检出限分别为0.2 μg/mL，0.6 μg/mL (S/N = 3)，精密度相对标准偏差(RSD)小于1%和日内的精密度的相对标准偏差(RSD)都小于3%，说明该方法重现性好，精密度高。样品的加标回收率为96.94% (没食子酸)、92.56% (阿魏酸)，相对标准偏差(RSD)都小于3%。进一步表明该方法快速简便、灵敏度高、重现性好、适用性强。
3) 测定六种不同产地山茶油中没食子酸和阿魏酸的含量测定。在6种样品中检测到了不同浓度的没食子酸、阿魏酸组分，1-湖南号中的没食子酸含量最高，1-湖南号其次。阿魏酸含量最高的是1-湖南号，但是阿魏酸6种山茶油中的含量都比较平均。