摘要: [目的]为筛选出对枸杞根腐病有生防作用的枸杞內生真菌，为枸杞根腐病防治提供理论依据。[方法]本研究通过组织分离法对3年生健康枸杞植株中的内生真菌进行分离；以枸杞根腐病主要致病菌——腐皮镰刀菌(
Fusarium
solani)和尖孢镰刀菌(
Fusarium
oxysporum)为供试菌，采用平板对峙法筛选致病菌的拮抗菌株，并通过形态学和分子生物学方法对拮抗菌株进行了种类鉴定。[结果]从枸杞植株中分离获得的64株内生真菌中，筛选得到对枸杞根腐病菌具有抑制效果的菌株L1-2，其中对腐皮镰刀菌的抑菌率为46.38%，对尖孢镰刀菌的抑菌率为45.13%。经鉴定菌株L1-2为苜蓿茎点霉(
Phoma
medicaginins)。苜蓿茎点霉发酵液处理后，枸杞组培苗叶片数、根长、茎长、最长叶长、干重和鲜重均有不同程度的增加，[结论]苜蓿茎点霉对腐皮镰刀菌，对尖孢镰刀菌有较好的拮抗作用，其发酵液也可以促进枸杞植株的生长。该研究结果可为有效利用微生物资源防治枸杞根腐病提供理论依据。
Abstract: Objective: To screen out the endophytic fungi of
Lycium
barbarum that have a bioprophylactic effect on root rot of
Lycium
barbarum, and to provide a theoretical basis for the control of root rot of
Lycium
barbarum. Methods: In this study, endophytic fungi were isolated from 3-year-old healthy
Lycium
barbarum plants by tissue isolation method;
Fusarium
solani and
Fusarium
oxysporum, the main causal organisms of
Lycium
barbarum root rot, were used as test organisms, and the antagonistic strains of the causal organisms were screened by the plate standoff method, and antagonistic strains were detected by morphological and molecular biological methods. The antagonist strains were identified by morphological and molecular biological methods. Results: Among the 64 endophytic fungi isolated from
Lycium
plants, strain L1-2 was found to have an inhibitory effect on Fusarium root rot of Lycium, with an inhibition rate of 46.38% against
Fusarium verticillioides, and that of
Fusarium acuminatum was 45.13%. The strain L1-2 was identified as
Phoma
medicaginins. The number of leaves, root length, stem length, longest leaf length, dry weight and fresh weight of
Lycium
barbarum seedlings increased to different degrees after treatment with the fermentation broth of
Phoma
medicaginins. Conclusion:
Phoma
medicaginins have a good antagonistic effect on
Fusarium rotundum and
Fusarium spinosum, and its fermentation broth can also promote the growth of
Lycium
barbarum plants. The results of this study can provide a theoretical basis for the effective use of microbial resources to prevent and control root rot of
Lycium
barbarum.
1. 前言
枸杞(Lycium barbarum)是我国北方主要经济林树种之一，是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物，在我国华北北部、西北各地都有分布[1]。因其果实富含多种蛋白质、各类氨基酸和多种人体必需微量元素，而且还能促进人身体免疫力及抗衰老等作用，近年来枸杞也越来越受人们的喜爱[2]。但随着我国枸杞种植规模的扩大和种植年限的增加，化学农药的大量使用导致土壤生态平衡遭到破坏，根腐病大规模发生，并有逐年加重的趋势。研究显示，腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是造成枸杞根腐病发生的主要致病菌，在早期很难被发现，一旦发现，病根的溃烂非常严重，而且很难治疗，是一种毁灭性病害[3]。根腐病已经严重影响种植者经济收入和枸杞产业的健康发展。目前，枸杞根腐病的防治主要靠化学药剂。然而，由于化学农药滥用，使得环境土壤污染严重，而且这也使得在很多枸杞产品种检测出农药残留，这就让枸杞产品在国内外贸易中面临很大的问题[4]，因此筛选和使用高效、无残留的生物菌剂进行防治尤为重要。
植物内生真菌不但能够促进宿主植物的生长发育，而且能够增强其抗性，并与致病菌竞争养分和空间或产生某些抗菌素、水解酶等，从而影响其生长，使其死亡[5]。内生菌的这种特性使得其在生物防治方面迎来了研究热潮，已有学者在内生真菌对植物病害防止方面取得了一定进展，如吴启婷[6]分离自白术的一株拟茎点霉属的内生真菌发现其对3种白术根腐病病原菌均具有较强的抑制作用，其可作为白术根腐病生物防治的候选菌株。一些研究还表明内生菌次级代谢产物对一些病原菌有较强的抑制作用，夏桂汝[7]从黄海棠分离出一株内生真菌，发现其次级代谢产物对多种病原菌具有抑菌活性。
本研究通过组织分离法，从健康枸杞植株的根、茎和叶中分离出内生真菌。采用平板对峙法筛选出对腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用的菌株。根据它们的形态特征和16SrDNA序列分析，确定了它们的分类地位。并对枸杞组培苗是否具备促生作用做出评价，为有效利用内生真菌防治枸杞根腐病提供理论支持。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
2.1.1. 供试植株
3年生健康枸杞植株。
2.1.2. 供试病原真菌
腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，均由甘肃农业大学森保实验室提供，经活化后0~4℃保存备用。
2.1.3. 主要培养基及配方
(1) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200 g，无水葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL。
(2) 马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：土豆200 g，无水葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL。
(3) MS培养基：大量元素(含CaCl2∙2H2O、KNO3、KH2PO4等) 50 mL，微量元素(含KI、H3BO3、MnSO4∙4H20等) 5 mL，铁盐(含FeSO4∙7H2O、Na2∙EDTA∙2H2O) 5 mL，维生素(含肌醇、烟酸、甘氨酸等) 5 mL，IAA 1 mL，琼脂4.2 g，蔗糖15 g，蒸馏水1000 mL。
2.2. 试验方法
2.2.1. 内生真菌的分离纯化
采用组织分离法，取新鲜健康的枸杞植株茎部、叶片和根部，用水冲洗后自然晾干。在无菌环境中，将茎叶和根分别切成小块，放入0.1%的升汞溶液，在其中浸泡15~30 s后立即用无菌水漂洗3~5次，再用75%的乙醇溶液浸泡1 min后立即用无菌水漂洗3~5次，置于无菌滤纸上晾干。以植物材料的组织切口处放置于含有0.1%链霉素的PDA平板中培养，每个培养皿放置4块植物材料，设置6个重复，以植物组织消毒后最后一遍冲洗的无菌水洗涤液涂在PDA培养基上作为阳性对照。在28℃下培养至出现菌落，然后在菌落边缘挑出的菌丝分别接种于新的PDA平板上，经多次纯化后，在4℃下冷藏备用。
2.2.2. 枸杞内生真菌对病原真菌的平板对峙
采用平板对峙法，在PDA平板的两侧分别放置直径为5 mm的供试致病菌菌饼和枸杞内生真菌菌饼，两个菌饼相距5 cm。以不接内生真菌作为空白对照的情况下，在28℃恒温箱培养5~7 d后。测量病原菌的径向增长直径，并对其抑制速率进行了计算，根据结果筛选出具有较好的抗菌活性的菌株。
菌丝生长抑制率(%) = (对照菌落直径 − 处理菌落直径)/对照菌落直径 × 100。
2.2.3. 枸杞内生真菌的鉴定
采用形态学结合分子生物学鉴定方法。首先，将抑菌效果最好的内生菌株接种于PDA培养基中28℃培养7 d。用光学显微镜观察孢子形态、孢子柄和产孢结构。然后，根据形态学观察结果，通过查阅相关文献并结合真菌鉴定手册以及分子生物学鉴定，确定了该菌株的分类地位。
2.2.4. 发酵液对枸杞组培苗的促生作用探究
1) 发酵液的制备
将活化的内生真菌接种在PDA培养基上，在25℃培养箱中培养，待其产生孢子。加入无菌水，最终制成最终的浓度为1 × 108 mL–1的孢子悬浮液。在150 mL PDB培养基中加入1 mL的孢子悬浮液，置于28℃，160 r/min的摇床中培养7 d后，取出培养物，纱布过滤菌丝体，得到发酵液。
2) 发酵液对组培苗的促生作用
将发酵液与MS培养基按体积比1:9的比例混合，以同等体积的PDB纯培养基作为对照。待高温灭菌的MS培养基温度降至20~25℃后，将枸杞组培苗小段，按其形态学上端向上、形态学下端向下，分别接苗，置于28℃培养箱培养10 d后(必须有根长出)，观察其生长状况，再分别测定组培苗的叶片数、根长、茎长、叶长、鲜重和干重。
2.3. 数据处理
数据统计整理采用Excel 2010进行，SPSS 26.0软件用于P = 0.05水平的方差分析。
3. 结果与分析
3.1. 枸杞内生真菌的分离与筛选
试验共分离出64株内生真菌，通过对峙培养，筛选出对腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有最明显拮抗作用的菌株L1-2，且有明显的抑菌带(图1)。
Figure 1. Inhibition of strain L1-2 against F. solani (A) and F. oxysporum (B)
图1. 菌株L1-2对腐皮镰刀菌(A)和尖孢镰刀菌(B)的抑制作用
3.2. 菌株L1-2对两种病原真菌的拮抗作用
PDA平板对峙结果显示，菌株L1-2对腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)均有明显的拮抗作用，抑制率分别为46.38%和45.13% (表1)。
Table 1. Inhibition effect of strain L1-2 on two tested pathogens
表1. 菌株L1-2对两种供试病原菌的抑制效果
供试病原菌 |
尖孢镰刀菌 |
腐皮镰刀菌 |
对照组菌落直径(mm) |
53.45 ± 0.4961 |
53.28 ± 0.9112 |
处理组菌落直径(mm) |
28.65 ± 0.5750 |
29.17 ± 0.7390 |
抑菌率(%) |
45.13 |
46.38 |
3.3. 菌株的鉴定
采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定，通过形态学观察(图2)：菌落底部颜色为炭黑色，表面菌丝有橄榄色、炭黑色、白色，菌丝絮状有隔，分生孢子器炭黑色、分生孢子器的壁由多层疏松菌丝交织而成，分生孢子梗很短，有分枝，也有不分枝。分生孢子单生于梗的末端如呈椭圆形、卵形、等单细胞，结合内生真菌的生长特点，结合孢子形态，参照《真菌鉴定手册》，初步认定L1-2为半知菌门球壳孢目的茎点霉属(Phoma sp.)内的一种真菌。
注：A：菌丝形态；B：分生孢子及分子孢子梗；C：菌落形态
Figure 2. Morphological observation of mycelium
图2. 菌丝形态学观察
分子生物学鉴定(图3)：GenBank中已有序列进行核酸BLAST比对分析，得到与GenBank中已有序列同源性较高的菌种信息，与Phoma medicaginins序列同源性最高，为100%。用MEGA7.0软件进行多序列比对，用NJ法构建rDNA-ITS序列的系统进化树，确定其属于苜蓿茎点霉(Phoma medicaginins)，且与 Phoma medicaginins KT192351.1聚在同一个分支上，相似度最高。
Figure 3. Phylogenetic tree based on ITS sequence
图3. 基于ITS序列的系统发育树
3.4. 苜蓿茎点霉发酵液对组培苗促生作用
Table 2. Growth-promoting effects of endophytic fungi on wolfberry seedlings
表2. 内生真菌对枸杞苗的促生作用
|
叶片数(个) |
根长(mm) |
茎长(mm) |
最长叶长(mm) |
干重(mg) |
鲜重(mg) |
CK |
1.60 ± 0.4000 |
1.24 ± 0.1610 |
14.32 ± 1.3012 |
27.14 ± 1.1390 |
70.80 ± 1.1350 |
595.40 ± 0.0781 |
处理 |
6.80 ± 0.5831 |
4.63 ± 0.3931 |
27.05 ± 4.1031 |
37.83 ± 3.8191 |
73.81 ± 1.2661 |
774.61 ± 0.1874 |
由表2和图4可知，处理组叶片数、根长、茎长和最长叶长较对照有明显的增加，其中叶片数增加了61.90%、根长增加了57.75%、茎长增加了30.77%、最长叶长增加了16.45%、鲜重增加了13.08%，说明苜蓿茎点霉发酵液可以促进枸杞植株的生长。
Figure 4. Growth of seedlings in the control group and the experimental group
图4. 对照组与实验组幼苗生长情况
4. 讨论与结论
枸杞根腐病是一种危害较大的维管束系统病害，一旦发生，整个植株就会枯萎，造成很大的破坏。近年来，随着我国枸杞生产规模的扩大，该病害的危害日趋严重，而化学防治带来的种种问题也日益加重。未来，以生物防治取代化学防治将成为今后农业生产的主要手段，而生防内生菌是其技术的核心和关键[8]。
本研究从3年生健康枸杞植株中共分离得到64株内生真菌，其数量分布根 > 叶 > 茎，这与杜晓宁[9]和刘建利[10]对枸杞内生真菌的分布研究结果略有差异，可能是由于品种、树龄以及不同环境因素等的影响造成。通过对峙试验，筛选出一株对枸杞根腐病致病菌F. solani和F. oxysporum具有拮抗效果的内生真菌，经鉴定为苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis)。茎点霉属(Phoma sp.)作为内生真菌可在多种植物中分离得到。Maha等人[11]在巴西橡胶树内生真菌的分离中得到草茎点霉(Phoma herbarum)。陈婕[12]的研究表明茎点霉属为杨树内生真菌优势种群。苜蓿茎点霉发酵液处理枸杞组培苗后，其叶片数、根长、茎长、最长叶长、干重和鲜重均有不同程度的增加，这与焦诗雨等[13]的研究结果一致，表明苜蓿茎点霉发酵液可以促进枸杞植株的生长。
本实验分离得到的枸杞内生真菌苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis)对枸杞根腐病菌具有良好的拮抗效果，对枸杞植株具有促生作用，为枸杞生产及根腐病的绿色防控提供优质资源。目前，关于枸杞内生真菌的研究还相对较少，其作为生防菌株防治病害的作用机理尚不明确，因此，后期有必要对内生拮抗菌株的抗菌作用方式以及田间试验进行更加深入的研究。
NOTES
*通讯作者。