1. 引言
银杏归属于银杏科、银杏属，2020年版《中国药典》中指出银杏叶有活血化瘀、通络止痛、化浊降脂等功效，临床主要用于对瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫和肺虚咳喘等疾病的治疗[1]。银杏酮酯是从银杏叶中提取的一种有效成分，它通过“双重吸附，双重去除”的工艺进行富集[2]。银杏酮酯制剂可用于治疗冠心病、脑血管疾病、认知障碍、糖尿病周围神经病变等多种疾病[3]。与西药联合使用时，它可以增效减毒，且没有明显的不良反应。药理研究显示，银杏酮酯在心脑血管疾病、神经系统疾病、脂代谢和氧化应激方面具有广泛的药理作用[4]。它能够抗血小板聚集、抗氧化、促进神经损伤后的再生、减轻心肌缺血性损伤、抗心律失常、改善血流变异常、延缓相关功能的退行性改变，以及缓解抑郁样行为[5]。与其他银杏叶提取物相比，银杏酮酯的药效成分含量更高，而毒性成分含量更低。
现在已知银杏酮酯含有73个已知化学成分，约占银杏酮酯的75.6%，共可分为四类：银杏总黄酮(黄酮醇苷及其苷元、黄酮苷及其苷元、异黄酮和双黄酮)、萜类内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)、黄烷醇和有机酸[6] [7]。银杏酮酯中的萜类内酯是一类具有显著药理作用的化合物，主要从银杏叶和根中提取得到，这类化合物作为强效的血小板活化因子(PAF)拮抗剂，以及非特异性甘氨酸受体和氨基丁酸受体的拮抗剂，在心脑血管疾病的治疗中得到了广泛应用[8] [9]。自从发现银杏叶提取物中的内酯成分具有PAF拮抗活性以来，许多科学家对这类化合物的构效关系、结构修饰、药理药效等方面进行了大量研究，银杏内酯因其疗效好、毒副作用小而备受关注，具有良好的发展趋势[10] [11]。银杏内酯、银杏内酯衍生物及其制剂的研发，预计将带来显著的经济和社会效益。此外，银杏萜类内酯在治疗认知障碍方面也显示出潜力，认知障碍的病因复杂，包括阿尔茨海默病和血管性痴呆等。银杏萜类内酯具有多靶点、多途径治疗的特点，其主要成分银杏内酯A、B、C及白果内酯，通过抗氧化应激、抗炎性反应、抗凋亡等多种机制，对治疗认知障碍展现出潜在效果[12] [13]。
近红外光谱技术(NIR)是一种快速、无损的分析方法，适用于制药过程中的原料药与辅料质量控制、药物理化参数分析、药物活性组分分析等[14]-[17]。这项技术具有原位无损分析、分析成本低、速度快、易实现在线检测等特点，对于提高药品质量控制和实现生产过程在线监控具有重要意义[18] [19]。化学计量学方法，如偏最小二乘法(PLS)，常用于处理近红外光谱数据，这些方法能够有效地分析和预测复杂数据，从而帮助提高制药过程的质量和效率，从而为生产过程中的质量控制提供有力支持[20]。本研究将利用化学计量学中通过降维方法计算霍特林T2控制限，判定建模光谱具有可靠性后，利用PLS定量分析算法建立银杏酮脂喷干粉中萜类内酯定量模型，通过定量模型对可以利用光谱与含量之间的相关性，预测萜类内酯含量，提供制药生产提供无损快速准确的检测方法。
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
银杏酮酯喷干粉药材(上海上药杏灵科技药业股份有限公司)；仪器信息见表1，试剂材料见表2。
Table 1. Experimental instruments and manufacturers
表1. 实验使用仪器及厂家
设备 |
厂家 |
MPAII近红外光谱仪 |
德国布鲁克公司 |
XP56型电子天平 |
梅特勒托利多集团 |
Angilent 1260高效液相色谱仪 |
安捷伦科技有限公司 |
Table 2. Reagents used in the experiment and their manufacturers
表2. 实验使用试剂及其厂家
试剂 |
厂家 |
级别 |
纯度 |
甲醇 |
默克股份两合公司 |
HPLC |
≤100% |
甲醇 |
国药集团化学试剂有限公司 |
AR |
100% |
丙酮 |
国药集团化学试剂有限公司 |
AR |
99.6% |
醋酸甲酯 |
国药集团化学试剂有限公司 |
AR |
98.4% |
白果内酯 |
上海诗丹德标准技术服务有限公司 |
/ |
99.2% |
银杏内酯C |
上海诗丹德标准技术服务有限公司 |
/ |
92.6% |
银杏内酯A |
上海诗丹德标准技术服务有限公司 |
/ |
94.3% |
银杏内酯B |
上海诗丹德标准技术服务有限公司 |
/ |
94.9% |
2.2. 近红外漫反射光谱采集
在银杏酮酯喷雾干燥生产末端每隔半小时采集样品，共63个。
光谱采集条件：使用MPAⅡ傅里叶近红外光谱仪利用漫反射原理采集银杏酮脂喷雾干燥生产过程中的样品，如图1。
Figure 1. Near infrared spectrum of ginkgo ester spray powder
图1. 银杏酮酯喷干粉近红外光谱
2.3. 银杏酮酯喷干粉萜类内酯的测定
银杏酮酯喷干粉中萜类内酯检测条件见表3。根据药典条件要求完成仪器系统适应性试验[1]。
Table 3. Chromatographic conditions for detection of terpenoid lactones
表3. 萜类内酯色谱检测条件
色谱柱 |
Waters Symmetry C18 5 µm, 4.6*150 mm |
检测器 |
示差折光检测器(RID)，光学设备温度35℃ |
柱温 |
30℃ |
流动相 |
甲醇–水 = 29:71 |
流速 |
1.2 mL/min |
进样量 |
10 μL |
洗脱时间 |
23 min |
参照高效液相色谱法(通则0512)测定萜类内酯含量方法，理论板数按银杏内酯A峰、银杏内酯B峰、银杏内酯C峰和白果内酯峰计算应不低于3000 [1]。
对照品溶液制备：分别在五氧化二磷减压干燥器中放置过夜的四个对照品各30 mg，精密称量，于50 mL量瓶中，甲醇稀释并定容[1]。
供试品溶液制备：取100 mg银杏酮酯喷干粉样品，精密称量，置索氏提取器中，加丙酮60 mL，置水浴中回流提取2小时，减压浓缩烘干，残渣用醋酸甲酯20 ml溶解，分液，剩余的残渣再用水10 ml溶解，合并，振摇，取上层酯溶液，水溶液再用醋酸甲酯20 ml振摇提取，合并，浓缩至干，残渣用流动相溶解，移至5 ml量瓶中并稀释至刻度，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取滤液，即得。
2.4. 数据处理
由于近红外光谱具有快速无损简便等优点，但同时也受到环境、散射效应、噪声、仪器基线漂移影响，导致光谱吸光度及趋势变化，导致无法对生产质量、过程分析等进行控制。从理论上来说，近红外光谱采用全波段建模并且不使用光谱预处理方法也可以实现定量校正模型的建立，但是实际过程中采集的光谱信息繁杂。此时，选取包含目标成分信息的波段，并且采用合适的光谱预处理提取有效信息就变得尤为重要且必不可少。常用作对光谱进行调整的预处理有SNV、MSC、MWPCS、SVD等，需根据光谱质量选择最优预处理方法。
2.5. 数据分析
由于光谱包含上千个波数，其中数据具有重复或冗余的，需要将光谱进行PCA降维分析，可有效剔除无关变量并提高后续数据分析的速度，提高模型的泛化能力，增强预测性能等作用。因此将预处理后数据进行PCA降维分析得到对应的得分值，再利用具有光谱代表性的得分值计算霍特林T2的控制限，表征光谱采集整体的一致性及稳定性。
2.6. 模型性能评价
将前期霍特林T2控制限下的光谱建立银杏酮酯喷干粉中萜类内酯用于含量测定的定量模型，并根据相关系数结果对模型稳定性、准确性及拟合效果进行考察。并通过对预测数据与真实值之间显著性及差值正太分布进行考察。
3. 结果与讨论
3.1. 银杏酮酯喷干粉萜类内酯含量测定结果
按照2.3项下的方法测定63个银杏酮酯喷干粉中萜类内酯含量，含量的范围6.8976%~14.017%之间。如表4所示。
Table 4. Contents of terpenoid lactones in ginkgo ester spray powder
表4. 银杏酮酯喷干粉中萜类内酯含量
样品编号 |
萜类内酯含量(%) |
样品编号 |
萜类内酯含量(%) |
20240528-1 |
9.416 |
20240612-10 |
14.017 |
20240528-2 |
8.901 |
20240613-1 |
8.203 |
20240529-1 |
9.615 |
20240613-2 |
10.850 |
20240529-2 |
9.928 |
20240613-3 |
10.786 |
20240529-3 |
9.752 |
20240613-4 |
10.082 |
20240529-4 |
8.842 |
20240613-5 |
10.295 |
20240529-5 |
8.547 |
20240613-6 |
11.996 |
20240529-6 |
8.673 |
20240613-7 |
10.859 |
20240604-1 |
8.569 |
20240613-8 |
10.663 |
20240604-2 |
8.832 |
20240613-9 |
10.233 |
20240604-3 |
9.977 |
20240613-10 |
7.609 |
20240604-4 |
10.601 |
20240613-11 |
7.950 |
20240604-5 |
9.490 |
20240620-1 |
9.453 |
20240604-6 |
8.500 |
20240620-2 |
10.289 |
20240605-1 |
10.700 |
20240620-3 |
8.996 |
20240605-2 |
9.368 |
20240620-4 |
7.244 |
20240605-3 |
8.603 |
20240620-5 |
10.212 |
20240605-4 |
9.574 |
20240620-6 |
10.640 |
20240605-5 |
9.975 |
20240620-7 |
10.560 |
20240605-6 |
7.162 |
20240620-8 |
7.905 |
20240605-7 |
8.903 |
20240620-9 |
8.027 |
20240605-8 |
8.326 |
20240620-10 |
8.742 |
20240612-1 |
9.637 |
20240621-1 |
10.152 |
20240612-2 |
10.235 |
20240621-2 |
9.471 |
20240612-3 |
10.028 |
20240621-3 |
9.315 |
20240612-4 |
9.493 |
20240621-4 |
8.517 |
20240612-5 |
11.870 |
20240621-5 |
9.503 |
20240612-6 |
10.607 |
20240621-6 |
8.899 |
20240612-7 |
9.061 |
20240621-7 |
9.569 |
20240612-8 |
8.526 |
20240621-8 |
9.466 |
20240612-9 |
8.551 |
20240621-9 |
7.245 |
20240621-10 |
6.898 |
|
|
3.2. 光谱数据处理
根据2.4~2.5项数据处理方法，使用SNV预处理消除散射效应及基线漂移如图2所示，预处理过的光谱数据信息更为高效及流畅。将处理后的光谱数据使用PCA降维，选择三个主成分(≥80%)得分值(如图3)，计算得到63个样品的Hotelling’s T2值，及整体采集的控制线如图4所示。
Figure 2. Pretreatment spectra of ginkgo ester dry powder
图2. 银杏酮酯喷干粉预处理光谱
Figure 3. Interpretive variance of ginkgo ester dry powder spectrum
图3. 银杏酮酯喷干粉光谱的解释方差
Figure 4. Hotelling’s T2 control chart for ginkgo grease spray dry powder
图4. 银杏酮脂喷干粉Hotelling’s T2控制图
将通过前期Hotelling’s T2判定的光谱对应测定理化值数据相对应，使用PLS法建立银杏酮酯萜类内酯的含量模型，得到模型如图5所示。
Figure 5. Schematic diagram of terpene lactone model of ginkgo ester spray powder
图5. 银杏酮酯喷干粉萜类内酯模型示意图
通过比较发现，银杏酮酯喷干粉萜类内酯模型相关系数指标结果较好，如表5所示。
Table 5. Parameters of terpenoid content model
表5. 萜类内酯含量模型参数
建模方法 |
PLS–交叉验证–留一法 |
指标 |
SEC |
SEP |
R2V |
R2C |
萜类内酯 |
0.356 |
0.372 |
0.9035 |
0.9715 |
3.3. 准确性考察
Figure 6. Prediction effect of terpenoid lactones
图6. 萜类内酯预测效果图
为保证模型的稳定性，继续收集银杏酮酯生产喷雾干燥粉样品56个，按照2.3项下内容对样品进行理化值检验及光谱进行Hotelling’s T2定性判别分析，通过后，得到验证集样本的真实值与预测值对比。根据结果可知，数值接近，符合中药分析要求，如图6。
3.4. 显著性考察
Table 6. t-test list
表6. t检验表
t-检验：成对双样本均值分析 |
|
变量1 |
变量2 |
平均 |
9.56 |
9.66 |
方差 |
1.464 |
1.298 |
观测值 |
56 |
56 |
泊松相关系数 |
0.951 |
|
假设平均差 |
0 |
|
df |
55 |
|
t Stat |
0.012 |
|
P (T ≤ t)单尾 |
0.495 |
|
t单尾临界 |
1.673 |
|
P (T ≤ t)双尾 |
0.990 |
|
t双尾临界 |
2.004 |
|
为了确定数据的差异及关系是真实存在而非随机因素导致，因此对数据进行显著性考察。根据显著性分析结果，P > 0.05，真实值与预测值之间无显著性差异，如表6。
3.5. 差值的正态分布
为验证模型的可靠性，对比真实值与预测值之间的差值分布。结果可知，P > 0.05，表明差值符合正态分布，如图7。
Figure 7. Normal distribution test histogram
图7. 正态分布检验直方图
4. 结论
本研究针对银杏酮酯喷干粉中萜类内酯含量进行检测，并通过PCA降维数据通过对累计贡献率的判定，选定3个主成分数，并计算整体光谱范围T2值为8.6857，判定后续建模光谱的一致性。在通过前期判定合格的光谱建立萜类内酯含量模型，通过对相关系数指标判定sec和sep小且接近、R2V和R2C接近1，符合模型建立要求，并通过模型准确性和成对样本T检验进行对模型数据进行考察，得到准确快速的检测模型，通过本研究内容可以实现银杏酮酯喷干粉生产预测准确且快速的放行方法。