1. 引言

烟草(Nicotiana tabacum L.)是茄科烟草属植物。烟草是我国重要的以叶片为收获器官的经济作物，其产区遍布贵州全省，烟草产业是贵州的传统优势产业和重要支柱产业。而烤烟的种植极易受到自然灾害的影响，随着全球气候变化问题的日益加剧，旱灾、涝灾、冰雹等自然灾害越发频繁发生，对烟叶的产量和品质产生了严重威胁。因此，提高烤烟品种的抗逆性尤为重要。根系构型的变化是植物常见的应对逆境的形态结构适应性变化之一，其形态和生理对地上部的生长发育和抗逆性均具有重要作用[1]。此外，根系结构是地下资源捕获和整体植物适应性的重要决定因素，探究调节根系结构及其可塑性的分子机制是提高农业生产力和可持续性的关键。因此，根系研究是当前研究的热点。

目前关于侧根的形成原因有两类假说：一是原生木质部细胞生长素响应呈现最大时，激活其临近的中柱鞘细胞；其二是中柱鞘细胞生长素累积，达到一定阈值就可以使其发生垂周分裂[2]。侧根的发生，还受到植物其它内源激素及其生活的外部环境条件的共同调控，植物几大类激素都在侧根形成过程中起到或多或少的作用，其中生长素与侧根发育有显著的关联性。生长素决定中柱鞘细胞的特化，参与植株新侧根的建成。已有研究人员证实，生长素精密调控拟南芥侧根发育及脱黄化幼苗下胚轴产生不定根的主要过程。活性氧通过调控生长素水平诱导拟南芥下胚轴上不定根的发生[3]。与生长素极性运输相关基因的突变及对植株进行生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(1-N-naphthylphthalamic acid, NPA)处理均会导致植株侧根及不定根出现发育缺陷现象。虽然不同植株的侧根及不定根在形态上具有较大差异，但在细胞水平上，生长素可能通过类似的作用机制调控侧根及不定根的发育。

生长素在植物整个生长发育过程中均起到非常重要的作用，是植物构型的主要调节因子[4]。生长素是一种通过极性运输系统动态分布的小分子，具有两种运输方式，一是通过维管系统运输的被动运输；另一种为耗能的主动极性运输，是生长素运输最主要形式。由此产生的生长素浓度梯度、最小值和最大值，可控制植物的生长发育。生长素必须通过PIN和PIN-Likes (PILS)等基因家族的外排转运蛋白从细胞中输出[5]。PILS在结构上与PIN相似，在内质网运输生长素方面的功能类似，但它们在植物谱系中是独立进化的[6]。生长素偶联物被认为在活性植物激素吲哚-3-乙酸(IAA)的储存形式发挥重要作用，因此，内质网上的细胞内生长素运输被认为在细胞生长素稳态中发挥作用。完全保留在内质网上的PILS蛋白控制生长素的核丰度和信号传导。其中，PILS6基因相关报道较多，在拟南芥中，高温会抑制PILS6蛋白丰度，从而影响根和根扩张中的PILS6依赖的生长素信号传导[7]。另有研究表明，高温能诱导PILS6蛋白的转运，从而介导生长素依赖的根部热形态发生[8]。在玉米中，ZmPILS6基因在控制生长素在初生根中的空间分布方面起着至关重要的作用[9]。我们可推测PILS6基因可能在感知外界环境的变化并整合到植物生长的过程中，影响植物的生长发育。

探究根系的生长调控及其构型性状的遗传改良是至关重要的。植物激素生长素在从细胞到整个根系水平的发育几乎都起着核心作用。本研究从基础的研究角度出发，全基因组鉴定烟草NtPILS6基因，并对其进行生物信息学分析与表达模式分析，旨在初步解析NtPILS6基因在烟草生长发育过程中的生物学功能，为NtPILS6基因在烟草根系生长发育过程中的功能验证奠定基础，为烤烟品种的遗传改良提供理论基础和基因资源。

2. 材料与方法

2.1. NtPILS6基因的鉴定

以拟南芥AtPILS6基因的核酸序列和氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST比对出在烟草基因组中的同源NtPILS6基因，进一步利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析保守结构域和利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜结构域，根据分析结果筛选出最终的NtPILS6基因[10]。

2.2. NtPILS6蛋白理化性质及亚细胞定位预测

利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam)对NtPILS6蛋白的理化性质进行分析；利用CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/)对NtPILS6蛋白进行亚细胞定位预测[10]。

2.3. PILS6蛋白系统进化分析

利用MEGA 11软件的ClustalW功能，将烟草与拟南芥的PILS6氨基酸序列进行多重序列比对，将比对后的序列以Neighbor-joining (NJ)方法，1000次重复，构建系统进化树[10]。

2.4. 烟草NtPILS6基因结构和氨基酸序列保守结构分析

将NtPILS6基因的cds序列和基因组序列通过Gene Structure Display Server (GSDS) (https://gsds.gao-lab.org/)在线比对，获得NtPILS6基因的外显子与内含子结构图。NtPILS6蛋白保守基序通过MEME 5.5.4分析(https://meme-suite.org/)获得[10]。

2.5. NtPILS6基因启动子顺式作用元件分析

在烟草基因组序列中调取已鉴定的4个NtPILS6基因起始密码子ATG上游2000 bp的核苷酸序列。启动子顺式作用元件分析通过PlantCare网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线完成，利用TBtools软件对结果进行可视化处理[10]。

2.6. NtPILS6基因表达模式分析

从烟草数据库中选取NtPIL6基因(Nta17g07840.1, Nta18g06260.1, Nta20g08460.1, Nta23g21260.1)在种子(播种后3天)、幼苗期和旺长期的根、叶组织，以及猫耳期干旱处理1、2、4、8天的整株中的表达数据，通过FPKM值估计基因的表达水平。

3. 结果与分析

3.1. NtPILS6蛋白的生物信息学分析

3.1.1. NtPILS6蛋白理化性质分析

在烟草基因组中共筛选出20个NtPILS基因家族成员，并根据其与拟南芥AtPILS6基因的同源性比对得到4个NtPILS6基因家族成员(基因ID分别为Nta17g07840.1、Nta18g06260.1、Nta20g08460.1和Nta23g21260.1) (表1)。

Table 1. Physicochemical properties of tobacco NtPILS6 protein

表1. 烟草NtPILS6蛋白理化性质

Figure 1. Three-dimensional structure of tobacco NtPILS6 protein ((a) Nta17g07840.1, (b) Nta18g06260.1, (c) Nta20g0846.1, (d) Nta23g21260.1)

图1. 烟草NtPILS6蛋白三维结构((a) Nta17g07840.1, (b) Nta18g06260.1, (c) Nta20g0846.1, (d) Nta23g21260.1)

鉴定的4个NtPILS6基因分别分布在烟草17、18、20、23号染色体上。NtPILS6蛋白成员的氨基酸数量在406~425之间，分子量在44.31~46.30 kDa之间，等电点在8.92~9.06之间，不稳定系数在35.56~38.15之间，脂肪族氨基酸指数在116.82~119.51之间，亲水性平均值在0.58~0.64之间，其三维结构如图1所示。

蛋白质亚细胞定位预测结果表明，烟草Nta17g07840.1、Nta18g06260.1、Nta20g0846.1、Nta23g21260.1基因均定位在细胞质膜上。NtPILS6蛋白均具有典型的跨膜结构，即在N-和C-末端具有两个高度保守的疏水性跨膜区和一个中心亲水环，通过DeepTMHMM预测的跨膜结构均有10个(图2)。

Figure 2. Transmembrane structure analysis of tobacco NtPILS6 protein

图2. 烟草NtPILS6蛋白跨膜结构分析

3.1.2. 烟草NtPILS6蛋白的系统进化分析

从构建的系统发育树可知，Nta17g07840.1、Nta18g06260.1、Nta20g0846.1、Nta23g21260.1与拟南芥AtPILS6蛋白同源性最高(图3)。通过对烟草与拟南芥AtPILS家族进化关系研究，有助于了解烟草NtPILS6蛋白可能的生物学功能，由此我们推测，NtPILS6基因在烟草根系发育中可能具有AtPILS6基因类似功能，但仍需进一步验证。

3.1.3. 烟草NtPILS6基因结构及氨基酸序列保守结构分析

烟草NtPILS6基因保守比对结果显示，NtPILS6基因都具有12个高度保守的基序，NtPILS6基因编码调控区有10个。将cds序列和基因组序列进行比较，我们获得了NtPILS6基因外显子–内含子结构图(图4)，其中Nta17g07840.1基因有3个内含子，10个外显子；Nta18g06260.1基因有0个内含子，10个外显子；Nta20g0846.1基因有3个内含子，10个外显子；Nta23g21260.1基因有3个内含子，10个外显子，可帮助我们进一步理解NtPILS6基因信息。

3.1.4. NtPILS6基因启动子顺式作用元件分析

利用在线软件PlantCare分析NtPILS6基因上游2000 bp的启动子序列，发现其中包含多种顺式作用元件，包括厌氧响应元件、光响应元件、玉米蛋白代谢调节响应元件、胚乳特异性响应元件、低温响应元件、干旱响应元件、昼夜节律控制响应元件以及脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸等激素响应元件(图5)。

Figure 3. Phylogenetic analysis of tobacco and Arabidopsis PILS6 proteins

图3. 烟草、拟南芥PILS6蛋白系统发育分析

Figure 4. Conserved motifs, conserved domains, and gene structure of tobacco NtPILS6 gene

图4. 烟草NtPILS6基因保守基序、保守结构域、基因结构

Figure 5. Prediction of cis-acting elements in the promoter region of tobacco NtPILS6 gene

图5. 烟草NtPILS6基因启动子区域顺式作用元件预测

3.2. NtPILS6基因的组织表达模式分析

从烟草数据库中获取的烟草种子(播种后3天)、幼苗期和旺长期的根、叶组织，以及猫耳期干旱处理1、2、4、8天的整株NtPILS6基因表达量。结果如图6显示，NtPILS6基因在根、叶中有表达，除Nta23g21260.1基因在幼苗期叶片中表达量高于根，其他基因均在根中表达量最高。此外，干旱胁迫下，4个基因均表达上调，均响应干旱胁迫，其中Nta20g0846.1、Nta23g21260.1的基因表达量相较于Nta17g07840.1、Nta18g06260.1的基因表达量更高。

Figure 6. Heat map of tissue expression patterns of tobacco NtPILS6 gene

图6. 烟草NtPILS6基因组织表达模式热图

4. 讨论与结论

本研究对烟草中的NtPILS6基因进行了系统的生物信息学分析与表达模式分析，旨在揭示这些基因在烟草生长发育过程中的潜在功能。通过BLAST工具在烟草基因组中鉴定出4个NtPILS6基因(Nta17g07840.1, Nta18g06260.1, Nta20g08460.1, Nta23g21260.1)，这些基因各自独立地分布于4条不同的染色体上，表明NtPILS6基因家族在烟草基因组中的分布具有一定的分散性。

生物信息学分析显示，NtPILS6蛋白的氨基酸数量、分子量、等电点等理化性质在家族成员间具有一定的相似性，但也存在一定的差异。亚细胞定位预测结果显示，NtPILS6蛋白定位于细胞质膜，具有典型的跨膜结构，这一结果与PILS家族蛋白通常作为生长素输出载体的功能相符合，可能与生长素的极性运输和根系发育密切相关。系统进化分析揭示了烟草NtPILS6蛋白与拟南芥AtPILS6蛋白之间的高度同源性，表明这些基因在进化过程中可能保留了相似的生物学功能。进一步推测，NtPILS6基因在烟草根系发育中可能具有与拟南芥AtPILS6基因相似的功能，如调节生长素的极性运输和根系发育。基因结构及保守结构域分析表明，NtPILS6基因具有相似的外显子–内含子结构，并含有多个高度保守的基序。可推测NtPILS6基因具有高度的保守性，以及这些保守的基序可能是NtPILS6基因执行其生物学功能的关键区域[11]。启动子顺式作用元件分析显示，NtPILS6基因的启动子区域包含多种与光、植物激素以及环境胁迫响应紧密相关的顺式作用元件。这些元件的存在可能使NtPILS6基因在响应外界环境变化时发挥重要作用，从而调节烟草的生长发育。表达模式分析表明，NtPILS6基因在烟草的不同发育阶段和组织中均有一定的表达，特别是在根中表达较为显著，推测其功能可能与烟草根系的生长发育相关。此外，干旱胁迫下，4个NtPILS6基因均表达上调，响应干旱胁迫，表明这些基因可能参与了烟草对干旱胁迫的响应。这些结果为进一步研究NtPILS6基因在烟草生长发育和逆境响应中的具体功能提供了重要线索。研究结果将为更加深入地理解NtPILS6基因家族及其在烟草根系生长发育过程中的功能验证奠定基础，为烤烟品种的遗传改良提供理论基础和基因资源。

然而，本研究仍存在一些局限性，需要在未来的研究中进一步完善和探讨。首先，本研究主要通过生物信息学手段对NtPILS6基因进行了鉴定和分析，尽管我们进行了亚细胞定位的预测与验证，但并未直接通过实验手段验证NtPILS6蛋白在细胞内的精确定位和生物学功能。未来的研究应结合蛋白质组学和细胞学技术，进一步确认NtPILS6蛋白的亚细胞定位及其在细胞内的具体作用机制。其次，本研究的表达模式分析主要基于数据库中的转录组数据，虽然这些数据在一定程度上反映了NtPILS6基因在不同发育阶段和组织中的表达情况，但仍需通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)等实验方法进行验证，以更准确地评估这些基因在不同条件下的表达变化。此外，本研究虽然发现NtPILS6基因在干旱胁迫下表达上调，并推测这些基因可能参与了烟草对干旱胁迫的响应，但并未深入探究NtPILS6基因在干旱胁迫下的具体作用机制。未来可以通过基因敲除或过表达等手段，进一步分析NtPILS6基因在干旱胁迫下的功能，揭示其在植物抗逆性中的作用。最后，本研究主要关注NtPILS6基因在烟草生长发育和逆境响应中的潜在功能，但未涉及这些基因与其他植物激素或环境因子的交互作用。未来可以进一步探讨NtPILS6基因与植物激素信号转导途径的关系，以及NtPILS6基因在应对其他环境胁迫(如盐胁迫、高温胁迫等)中的功能，从而更全面地了解NtPILS6基因在植物生长发育和逆境适应中的作用。未来，我们将针对NtPILS6基因在烟草生长发育和逆境响应中的具体功能进行深入研究，以期为烤烟品种的遗传改良提供理论依据和实践指导。

基金项目

贵州大学实验室开放项目(SYSKF2024-83)，贵州大学大学生创新创业训练计划(2023SRT579, 2024SRT631)，贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字(2020) 21号)。

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。

参考文献