1. 引言

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)属于十字花科植物，作为一种重要的经济作物，“一菜多用”优势明显，油菜不仅是人类重要的食用油来源，而且在生物能源、药物、旅游观赏、蜜源、饲料、绿肥、蔬菜等领域发挥重要作用[1]。在油菜生产过程中同样面临着病虫害的严重危害，比如核盘菌侵染引起的菌核病导致油菜大量减产[2]。为了减少因病虫害带来的产量损失，必须使用化学农药加以防治，由此对人与环境的危害也就不可避免。为了减少化学农药危害，增强油菜自身抵抗病虫害的能力是降低化学农药使用量和其副作用的有效途径。萜类化合物是植物次生代谢产物中最大的一类，目前发现的萜类化合物已超过8万种，具有抗氧化、抗炎、抑制肿瘤等生物活性[3]，在植物生长发育和植物抗性方面也发挥关键作用。萜烯类化合物如沉香醇和石竹烯在花朵中的挥发可以吸引传粉昆虫，同时也可能具有抗菌作用，帮助植物防御病原体[4]。萜烯合成酶(Terpene synthases, TPSs)是植物萜类化合物合成的关键酶，主要参与单萜、倍半萜和二萜的生物合成[5]，TPSs催化是萜类化合物合成过程中的最后一个环节[6]。萜烯合成酶基因(TPSs基因)的表达受到多种转录调控因子的控制，这些转录调控因子协同工作以控制萜烯的生物合成[7]。AtTPS03是萜烯合成酶的AtTPS基因家族的成员[8]，它主要负责单萜的合成[8]。单萜由碳氢化合物组成，是最大一类植物次生代谢物[9]，单萜及其衍生物在生物和医学领域展现出多种重要作用，包括抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化等生物活性[10]。

有关甘蓝型油菜中TPSs基因在油菜挥发性气体成分合成中的作用报道极少，本研究对甘蓝型油菜中的TPSs基因BnaTPSA08-1进行了克隆和过量表达研究，并对过表达植株挥发性气体组分进行研究，验证BnaTPSA08-1可能与油菜什么挥发性有机化合物的合成有关，为进一步研究BnaTPSs基因在油菜中的生物学功能奠定基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

甘蓝型油菜材料“XY15”种子来自于湖南农业大学作物表观遗传调控与发育重点实验室。大肠杆菌DH5α感受态由本实验室保存，植物表达载体pFGC5941由本实验室提供。

2.2. 方法

2.2.1. 过量表达载体构建

以甘蓝型油菜cDNA为模板，构建反应体系如下：cDNA (300 ng) 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、2 × Phanta Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、引物F (10 μM) 0.5 μL、引物R (10 μM) 0.5 μL以及ddH₂O 21 μL，总体积为50 μL。PCR反应条件设置为：预变性95℃，持续3分钟；变性95℃，15秒；退火62℃，15秒；延伸72℃，45秒；最终延伸72℃，5分钟，共进行34个循环。使用引物BnaTPSA08-1-F(5'ATGAAAACACAGTCACAGCCTCT3')和BnaTPSA08-1-R(5'TTATGGAACAGGGTAGACGAGCA3')扩增带有酶切位点的BnaTPSA08-1的CDS片段。

通过胶回收试剂盒回收目标片段，并将回收的片段连接到pEASY载体上，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。涂抹到带有卡那霉素(Kan)的筛选培养基上，挑单菌落，根据以下反应体系进行菌落PCR验证：单菌落/菌液/DNA 1 μL、2 × Rapid Taq Master Mix 7.5 μL，引物F (10 μM) 0.2 μL，引物R (10 μM) 0.2 μL，以及ddH₂O 6.1 μL，总体积15 μL。PCR条件与前述相同，仅改变引物为pFGC5941-35S-2577F(5'ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC3')和BnaTPSA08-1-R，以确认转化成功样品。测序结果显示正确的，则进一步扩大培养后，用质粒提取试剂盒提取带目标片段的pEASY-BnaTPSA08-1 CDS质粒用于下一步。

在提取质粒后，根据以下酶切反应体系酶切与连接：质粒(1 ng) 1 µL，10 × buffer 2 µL，酶1 (NcoI)约0.5 µL，酶2 (XbaI)约0.5 µL及ddH₂O至20 µL。其中，对pEASY-BnaTPSA08-1 CDS和pFGC5941进行双酶切分别回收需要的片段；将大小正确片段再通过T4连接酶完成连接后，用DH5α感受态细胞转化大肠杆菌。同样挑选单菌落验证，如与预期一致，对检验合格的阳性株送去测序，对比分析测序结果。如确认无误，即可扩大培养并从中提取质粒。测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

2.2.2. 根癌农杆菌转化

采用电击转化法，将过表达载体pEASY-BnaTPSA08-1质粒转化至根癌农杆菌GV3101中。随后，将转化后的菌株涂布于含有50 µg∙mL⁻¹卡那霉素、50 µg∙mL⁻¹利福平和50 µg∙mL⁻¹庆大霉素的培养基上，以筛选阳性菌株。将平板放置于28℃摇床中培养2~3天后，挑取单个菌落进行阳性克隆的鉴定。

2.2.3. 遗传转化油菜

将XY15的种子消毒后，铺在发芽培养基上，在黑暗条件下避光生长6~7天后，取出切成0.8 cm长的下胚轴作为转化受体的外植体；用含有pEASY-BnaTPSA08-1质粒的农杆菌GV3101菌液浸染下胚轴15 min，取出下胚轴放在无菌纸上晾干，再平铺在共培培养基上，转入24℃培养室里，暗培养40~48 h；将通过共培后的下胚轴转移到诱导培养基上，在24℃，16 h光照/8 h黑暗条件的培养室中培养，待诱导出愈伤组织，21 d后将外植体转移至分化培养基，使愈伤组织分化出再生苗，期间每隔两周更换一次新的分化培养基，直到分化出新的叶芽；待分化出的叶芽长到一定程度后，转移到生根培养基中生根2~3周；之后将已经生根的小幼苗转移至蛭石中进行炼苗一周，再将小幼苗移栽至土壤中。

2.2.4. 转基因油菜的检测

待小花砵中的植株长出2~3片新叶，用CTAB法提取油菜叶片DNA，PCR检测引物对应：pFGC5941-35S-2577F(5'ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC3')和BnaTPSA08-1-R(5'TTATGGAACAGGGTAGACGAGCA3')。预计PCR产物的长度为1647 bp，产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2.2.5. 荧光定量PCR

按照荧光定量试剂盒检测体系，总体系为20 µL，取反转录后的cDAN 100 ng，2 × BioZues® HS Taq Universal SYBR Green qPCR Master Mix 10 µL，正向引物(10 µM)，反向引物(10 µM)，Nuclease-free water补足至20 µL，程序设置为50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 S，60℃ 1 min，40次循环；最终72℃ 30 S进行RT-qPCR分析。

2.2.6. 气体收集色谱条件

GC-MS分析条件：HB-88毛细管柱(100.0 m × 0.32 mm ×0.25 um)；载气为He (纯度99.9999%)；进样口温度：250℃；柱温：初始温度120℃，保持1 min、10 ℃/min升温至175℃，保持10 min、5℃min升温至210℃，保持5 min、5℃/min升温至230℃，保持15 min；柱流速：1.04 mL/min，分流比：20:1；离子源温度：200接口温度：220℃；质核比扫描范围：50~700 m/z；进样量：1 μL。

3. 结果与分析

3.1. 过表达载体pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1的构建

甘蓝型油菜BnaTPSA08-1基因克隆的上游引物的5'端添加限制性内切酶NcoI (CCATGG)和其保护碱基(CATG)，即BnaTPSA08-1-F，(CATGCCATGG)ATGAAAACACAGTCACAGCCTCT；下游引物5'端添加限制性内切酶XbaI (TCTAGA)和其保护碱基(GC)，即BnaTPSA08-1-R，(GCTCTAGA)TTATGGAACAGGGTAGACGAGCA。以携带目的基因的“XY15”基因组cDNA为模板，用高保真PCR扩增和胶回收目标片段。PCR反应体系：PCR反应体系：cDNA模板1 μL、dNTP Mix (10 mM each) 1 μL、2 × Phanta Max Buffera 25 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、BnaTPSA08-1-F/BnaTPSA08-1-R各1 μL、ddH₂O 19 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5 min。从而获得一条约1647 bp的带(图1)，随后将PCR反应产物在1.6%的琼脂糖凝胶中电泳检测，回收目的片段。

注：M：Trans2K® Plus II DNA Marker；1：目标片段PCR产物

Figure 1. BnaTPSA08-1 fragment PCR product

图1. BnaTPSA08-1片段PCR产物

将目的片段连接pEASY-Blunt载体进行测序，与ZS11基因组序列进行比对，结果如图2所示，克隆得到的序列为BnaTPSA08-1。

Figure 2. Sequencing results of BnaTPSA08-1 connected to the pEASY-Blunt vector

图2. BnaTPSA08-1连接pEASY-Blunt载体测序结果

用NcoI和XbaI对目的片段和pFGC5941-35S载体分别进行双酶切(如图3)，酶切体系(20 μL)：DNA 100 ng、FD Green buffe r2 μL、NcoI 1 μL、XbaI 1 μL、ddH₂O补足。37℃反应30 min。反应结束后进行琼脂糖凝胶检测并胶回收备用。

注：M：Trans2K® Plus II DNA Marker；1、2：Nco I、Xba I双酶切pFGC5941载体；P：阳性对照(未酶切)；N：空白对照

Figure 3. NcoI、XbaI double enzyme digestion pFGC5941 vector

图3. NcoI、XbaI双酶切pFGC5941载体

将胶回收后的目标片段和双元表达载体pFGC5941-35S进行连接反应，构建 pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1过表达载体。连接体系(10 μL)：Linear Vector DNA 50 ng、Insert DNA5:1 molar ratio over vecto、T4 DNA ligase 0.5 μL、10 × T4 DNA ligase Buffer 1 μL、Water，nuclease-free补足、22℃连接30 mim并转化大肠DH5α。挑取菌落进行PCR鉴定。对鉴定出的阳性菌落进行测序，以确保载体构建的准确性。成功构建的载体命名为pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1过表达载体(如图4)。

Figure 4. pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1 overexpression vector schematic

图4. pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1过表达载体简图

3.2. 农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化及转基因阳性植株的鉴定

将pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1转入农杆菌GV3101，使用引物pFGC5941-35S-2577F(ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC)和BnaTPSA08-1-R验证，PCR结果显示(如图5)，已成功转入GV3101的质粒，可作为后续油菜遗传转化制备侵染下胚轴的菌液。

注：M：Trans2K® Plus II DNA Marker；1~20：单菌落PCR产物，P为阳性对照pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1，N：空白对照

Figure 5. pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1 overexpression vector Agrobacterium colony PCR

图5. pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1过表达载体农杆菌菌落PCR

验证成功的农杆菌菌液，如2.2.2所述方法进行农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化。将成功炼苗的油菜抗性苗提取DNA，使用引物pFGC5941-35S-2577F和BnaTPSA08-1-R进行转基因油菜检测。最终通过遗传转化，得到28株抗性油菜，检测其中15株抗性油菜得到11株转基因油菜，阳性率为73%。转基因及抗性油菜统计表(如表1)所示，油菜遗传转化及转基因鉴定示意图(如图6，图7)所示。

Table 1. Statistical table of transgenic rape

表1. 转基因油菜统计表

注：M：250 bp DNA Ladder；1~15：抗性苗1-15号；N：空白对照p：质粒阳性对照；N：水空白对照。

Figure 6. Identification of expression frame of pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1 in rape material 1-15

图6. pFGC5941-35S::BnaTPSA08-1转油菜材料1-15表达框鉴定

提取转基因油菜的叶片RNA，逆转录为cDAN后，使用荧光定量PCR分析XY15 与转基因油菜中BnaTPSA08-1的相对表达水平，荧光定量PCR引物使用网站NCBI设计，其中正向引物为BnaA08-dlF:

注：a：铺种；b：下胚轴生长；c：共培养；d：愈伤组织诱导；e：愈伤组织再分化；f：生根后的再生苗；g：抗性苗生根；h：炼苗后的抗性苗

Figure 7. Schematic diagram of genetic transformation of rape

图7. 油菜遗传转化示意图

CGGGAACAAATATGCGAAAGAGG，反向引物为BnaA08-dlR: TCGGAACATAAGGGCAGTCG，采用2^−∆∆Ct法计算相对表达量并将野生型油菜相对表达量标准化为1，结果显示，在1号转基因油菜中，BnaTPSA08-1转录水平上调最高(如图8)。

注：符号^*表示在p < 0.05的概率水平上与CK有统计学意义上的显著偏差。

Figure 8. Detection of BnaTPSA08-1 transcription level in transgenic rape

图8. 转基因油菜中BnaTPSA08-1转录水平检测

3.3. 植株挥发性气体收集与组分测定

3.3.1. 定性检测

将四叶期的XY15与4号转基因油菜分别放入两个相同大小的器皿中，利用TA吸附管分别将两株试验材料进行挥发性气体收集，并分别使用正己烷将其稀释，定容至500 μL，使用2.2.3所述条件进行组分测定，通过岛津GCMS-QP2010毛细管色谱柱分离，质谱检测，得出2种色谱组物质分离图(图9、图10)其中，XY15中分离出有效成分3种，分别是1-(2-甲氧基-1-甲基乙氧基)异丙醇、2-(2-甲氧基丙氧基)丙醇和二乙二醇丁醚。而过表达BnaTPSA08-1油菜(OE010-4)中分离出有效成分25种，主要是烷类物质，其中多数为十一烷及十一烷的衍生物。

Figure 9. Chromatogram of various substances in wild type (WT) volatile gas collection of Brassica napus

图9. 甘蓝型油菜野生型(WT)挥发性气体收集中各物质色谱图

Figure 10. Chromatograms of various substances in volatile gas collection of overexpressed BnaTPSA08-1 rape (OE010-4)

图10. 过表达BnaTPSA08-1油菜(OE010-4)挥发性气体收集中各物质色谱图

3.3.2. 定量分析

通过对两种材料的挥发性成分进行定量分析(表2、表3)，WT植株中共鉴定出3种挥发物分别占比为1-(2-甲氧基-1-甲基乙氧基)异丙醇：15.545%、2-(2-甲氧基丙氧基)丙醇6.08%、二乙二醇丁醚77.96%，OE010-4植株中共鉴定到25种挥发物，其主要成分的相对占比为2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇双异丁酸酯35.86%，烷类物质37.95%，其中十一烷及十一烷衍生物16.09%。

Table 2. Relative contents of volatile components in WT plants

表2. WT植株挥发性成分相对含量组成

Table 3. Relative contents and composition of volatile components in overexpressed plants

表3. 过表达植株挥发性成分相对含量组成

从XY15与过表达植株之间挥发性成分种类与比例差异进行分析，两者间主要差异是过表达植株挥发性成分中有十一烷及十一烷衍生物，而XY15中没有。说明BnaTPSA08-1基因的主要生化功能是催化十一烷及其衍生物的合成。

4. 结论

本研究通过比较过量表达BnaTPSA08-1植株与受体材料XY15的有机挥发组分差异，结果显示过表达植株出现了XY15植株没有的十一烷及其衍生物的产生，说明BnaTPSA08-1基因的主要生化功能是催化十一烷及其衍的生物合成。

5. 讨论

萜类化合物是自然界中广泛存在的一类具有重要生理功能和显著生物活性的天然产物[11]，而萜烯合成酶类(Terpene synthases, TPSs)是植物萜类化合物合成的关键酶[12]，CsTPS21可以催化单萜类物质合成[13]，玉米中的ZmTPS6可以催化倍半萜物质合成[14]，拟南芥中的AtTPS03与AtTPS08催化单萜类物质合成[15] [16]，而甘蓝型油菜中的BnaTPSA08-1能催化十一烷及其衍的生物合成，这说明萜烯合成酶类不仅催化萜类物质的合成，还能催化烷类物质的生物合成，这是萜烯合成酶类作用的新发现，大大拓宽了人们对萜烯合成酶类生化功能的认知。

项目基金

国家重点研发计划项目(2022YFD1200400-3)，湖南省研究生科研创新项目(CX20230695)。

参考文献