1. 引言

失眠症是一种常见的睡眠障碍，现已成为影响人们生活质量的重要因素之一。其临床表现为：日间疲劳、嗜睡、记忆力衰退、注意力下降、情绪紊乱、易怒等[1]。有数据表明[2][3]，目前约有33%~50%的人患有慢性失眠症。该症临床多见于中老年群体，引发该症状的诱因较为复杂，目前学界仍未探明其具体机制。西医临床治疗方案多采用苯二氮卓类药物，长期使用会产生依赖性和成瘾性[4]，对患者的身体健康造成一定伤害。利用中药治疗失眠，具有低毒副作用、低成瘾性等优点[5]。因此，挖掘中国传统中药材以期治疗失眠具有独特优势[5]。

酸枣仁系鼠李科植物酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosa)的干燥成熟种子[6]。酸枣仁内含有皂苷、黄酮、脂肪酸、生物碱等化学成分[7][8]。临床实验表明，酸枣仁有镇静催眠[9][10][11]、抗惊厥[12]、抗焦虑[13][14]和抗抑郁[15]作用。

夜交藤，又名首乌藤，系萝科植物何首乌(Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson.)的干燥藤茎[6]。夜交藤含有二苯乙烯、醌类、类黄酮、磷脂和多种化合物，具有改善睡眠的功效[16][17]。

柏子仁为裸子植物柏科侧柏(Platycladusorientalis(L.) Franco)的干燥成熟种仁[6]。柏子仁内含柏木醇、谷甾醇和双萜类成分，以及少量挥发油、皂苷、维生素A和蛋白质，具有镇静安神、抗抑郁、抗阿尔茨海默病[18]、抗焦虑[19]等作用。

目前已有研究阐释酸枣仁[20]、夜交藤[21]治疗失眠症的作用机制，亦有对酸枣仁–柏子仁药对治疗失眠症的研究[22][23][24]，但无酸枣仁、夜交藤、柏子仁联合用药方案的研究。因此，本文采用网络药理学和分子对接技术，对柏子仁、酸枣仁和夜交藤三种传统中药材进行联合研究，探寻其治疗失眠症的作用机制。

2. 方法

2.1. 药物活性成分的筛选

利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索和筛选出酸枣仁、柏子仁和夜交藤的主要活性成分，控制条件为口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(Drug-Likenes, DL) ≥ 0.18[25]。

2.2. 药物活性成分相关靶点的收集

通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取化合物的SMILES信息，将SMILES信息导入Swiss TargetPrediction数据库(https://www.sib.swiss)获得化合物靶点信息，按照条件Probability > 0.2筛选出相关靶点。

2.3. 疾病靶点的获取

以“sleep”、“disorder”、“insomnia”为关键词，在Genecards (https://www.genecards.org)、TTD数据库(https://db.idrblab.net/ttd)中搜索得到与失眠症相关的疾病靶点，并进行整合去重。

2.4. 构建PPI网络

将药物相关靶点和疾病靶点导入Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)得二者交集靶点，并制作Venny图。将交集靶点上传至STRING数据库(https://cn.string-db.org/)中，筛选条件为“Homo sapien”，其他参数为默认设置，导出TSV格式文件到Cytoscape3.10.0软件中分析，构建药物与疾病共同靶点的蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction, PPI)，使用CytoNCA插件拓扑分析，以度值为条件筛选出关键靶点。

2.5. “中药–活性成分–疾病靶点”网络图的构建

将药物与疾病的交集靶点及药物对应的活性成分导入Cytoscape3.10.0软件中分析，构建“中药–活性成分–疾病靶点”网络图并进行可视化分析。

2.6. 交集靶点的富集分析

将获得的交集靶点录入DAVID (the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)数据库中(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)，选择标识符为“OFFICIAL GENE SYMBOL”，物种为“Homo sapiens”。进行GO富集分析和KEGG通路分析。其中GO功能注释包括：参与的生物学过程(Biological Process, BP)、细胞组分(Cellular Component, CC)及分子功能(Molecular Function, MF)。在KEGG数据库中除了对基因本身功能的注释，同时基因会参与人体的各个通路，得到的结果使用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行数据可视化处理。

2.7. 分子对接

将药物与疾病的交集靶点在Cytoscape软件上以度值高低为标准筛选的TOP 3酸枣仁、夜交藤、柏子仁药物中的关键活性成分与PPI网络PPARG、ESR1、PTGS2这三个与疾病关系密切且重要的在靶点进行分子对接。在TCMSP数据库得到活性分子的“mol2”格式信息，通过Profit数据库和RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)数据库得到靶点蛋白的三维结构，经Pymol软件去水、去配体处理，使用Autodock tools软件对蛋白加氢，识别蛋白结合位点，计算出对接口袋大小，进行分子对接，得到最小结合能，并利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 酸枣仁、夜交藤、柏子仁的活性成分的获取与筛选

运用TCMSP数据库检索并筛选(设置药动学参数为OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18为筛选条件)相关化合物，结果显示酸枣仁活性成分9个，柏子仁活性成分5个，夜交藤活性成分8个，见表1。

Table 1.Active substance ingredient list

表1.活性物质成分表

3.2. 酸枣仁、夜交藤、柏子仁的活性成分潜在靶点预测

将检索到的三种药物的活性成分在PubChem数据库中获取其对应的SWILES结构，录入Swiss Taeget Prediction网站并设置种类为“Homo sapiens”。筛选出酸枣仁潜在靶点27个，夜交藤潜在靶点24个，柏子仁潜在靶点34个。经删除重复项后得到酸枣仁、夜交藤、柏子仁活性成分潜在靶点共50个。

3.3. 疾病靶点的获取

从Gene Card和TTD数据库中检索失眠症相关靶点，Gene Card中搜索sleep disorder并去除评分小于或等于50分，筛选得到3086个作用靶点；Gene Card中搜索insomnia并去除评分小于或等于40分[21]。筛选得到2609个作用靶点；TTD中得到关于失眠症的相关靶点16个。删除重复靶点后获得相关靶点4635个。

3.4. 构建PPI网络

将酸枣仁、夜交藤、柏子仁相关靶点和疾病靶点导入Venny2.1.0作图，得交集靶点42个，如图1。将交集靶点上传至STRING数据中，筛选条件为“Homo sapien”，其他参数为默认设置，导出TSV格式文件到Cytoscape3.10.0软件中分析，得到PPI网络图，如图2。使用CytoNCA插件对核心聚类蛋白进行分析，PPI网络图中Degree值越大颜色越深节点越大，取Degree值前十靶点分别为过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、雌激素受体1(ESR1)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARA)、胆固醇合成的限速酶(HMGCR)、雌激素合成酶(CYP19A1)、类视黄酸受体alpha受体(RXRA)、雌激素受体2 (ESR2)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)以Betweenr Closeness、Degree、Eigenvector、Closeness值为筛选条件，得到核心靶点过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、雌激素受体1 (ESR1)、环加氧酶2 (PTGS2)，见表2。

Figure 1.Drug targets and disease targets Venn Chart

图1.药物靶点–疾病靶点韦恩图

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Figure2.PPI network diagram

图2.PPI网络图

Table2.Top 10 target information table

表2.Top 10靶点信息表

3.5. “中药–活性成分–疾病靶点”网络图的构建

将酸枣仁、柏子仁、夜交藤与疾病的交集靶点及药物对应的活性成分导入cytoscape3.10.0软件中分析，其中圆形，五边形，正方形，菱形分别代表酸枣仁活性成分，柏子仁活性成分，夜交藤活性成分，得到β-谷甾醇(β-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、植物甾醇(phytosterol)、槲皮素3-O-阿拉伯糖甙(quercetin3-O-arabinoside)、11，14-二十碳二烯酸(11,14-eicosadienoic acid)、5Z-二十碳二烯酸(5Z-eicosadienoic acid)等活性成分，如图3。以度值为筛选条件，得到重要活性成分谷甾醇(sitosterol)、植物甾醇(phytosterol)、槲皮素3-O-阿拉伯糖甙(quercetin3-O-arabinoside)，见表3。

Figure3.Traditional Chinese medicine - Active ingredients - Disease target map

图3.中药–活性成分–疾病靶点图

Table3.Partial active ingredient information table

表3.部分活性成分信息表

3.6. 交集靶点的富集分析

3.6.1. 交集靶点的GO功能富集分析

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Figure4.Enriched GO term BP, CC, MF three in one bar chart

图4.富集GO term BP，CC，MF三合一柱状图

采用DAVID数据库对酸枣仁、夜交藤、柏子仁化学成分和失眠症相关的42个潜在靶点进行GO分析。根据所富集的基因数对靶点进行排序，选取排名前10的条目进行可视化，绘制富集GO term BP，CC，MF三合一柱状图。图中横坐标为GO名称，纵坐标为富集的基因数(如图4)。结果得出酸枣仁、夜交藤、柏子仁在治疗失眠症作用靶点参与的生物学过程主要涉及对炎症反应的负调控(negative regulation of inflammatory response)、细胞内受体信号通路(intracellular receptor signaling pathway)、褐色脂肪细胞分化(brown fat cell differentiation)、胆固醇储存的负调控(negative regulation of cholesterol storage)、激素介导的信号通路(hormone-mediated signaling pathway)、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路(adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)、转录正调控，DNA模板化(positive regulation of transcription, DNA-templated)、RNA聚合酶II启动子对pri-miRNA转录的负调控(negative regulation of pri-miRNA transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter)、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控(positiveregulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、脂肪酸代谢过程的正向调节(positive regulation of fatty acid metabolic proces)。分子组分主要与核质(nucleoplasm)、染色质(chromatin)、内质网膜(endoplasmic reticulum membrane)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)、刷状缘膜(brush border membrane)、顶端质膜(apical plasma membrane)、受体复合物(receptor complex)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物(RNA polymerase Ⅱ transcription factor complex)、细胞质膜(plasma membrane)、内质网(endoplasmic reticulum)有关。分子功能主要与RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、锌离子结合(zinc ion binding)、序列特异性DNA结合(sequence-specific DNA binding)、酶结合(enzyme binding)、血红素结合(heme binding)、类固醇结合(steroid binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、转录辅激活因子结合(transcription coactivator binding)、雌激素反应元件结合(estrogen response element binding)有关。

3.6.2. 交集靶点的KEGG通路的富集分析

通过KEGG信号通路分析，筛选出富集得到的14条相关信号通路(P < 0.05)。对其进行可视化，绘制GO，Pathway富集结果气泡图(如图5)。图中横坐标表示通路的富集程度，数值越大，说明在研究数据中该通路越是显著。纵坐标列出了与疾病相关的生物学通路。寻找气泡大且颜色深的通路。这表示在这些通路中不仅有较多的基因表现出显著的活动，而且统计显著性也高。结果表明，研究涉及PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、化学致癌-受体结合激活(Chemical carcinogenesis- receptor activation)、脂肪细胞脂解的调控(Regulation of lipolysis in adipocytes)、癌症的通路(Pathways in cancer)、胞葬作用(Efferocytosis)、卵巢类固醇生成(Ovarian steroidogenesis)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、代谢途径(Metabolic pathways)、5-羟色胺能突触通路(Serotonergic synapse)、胰岛素抵抗通路(Insulin resistance)以及类固醇激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)等途径。

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Figure5.GO, Pathway enrichment results bubble chart

图5.GO，Pathway富集结果气泡图

3.7. 分子对接

以度值为筛选条件，利用AutoDock软件将所得酸枣仁、夜交藤、柏子仁药物TOP 3活性成分(sitosterol、phytosterol、quercetin 3-O-arabinoside)分别与PPI网络中的PPARG、ESR1、PTGS2关键靶点进行9次分子对接。结合能均为负数(见表3)表示酸枣仁、夜交藤、柏子仁药物活性成分与关键靶点能够不依赖于外界能量就可以自由结合。结合能数值越低，代表配体和受体的结合度越好，越容易发生作用。其中靶点PTGS2与phytosterol和sitosterol的结合能较低，分别为−10.52 KJ/mol和−6.68 KJ/mol。选取部分配体-受体的结合构象导入Pymol软件，展示3D对接示意图及对接分子口袋图，其中的3D对接示意图中，透明度较低浅灰色结构为受体，深灰色部分为受体上所对接的分子团，彩色结构部分为配体小分子，黄色虚线状部分为氢键，见图6。

Table4.Schematic diagram of molecular docking binding energy

表4.分子对接结合能示意图

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Figure6.3D docking diagram and docking molecule pocket diagram

图6.3D对接示意图及对接分子口袋图

4. 讨论

失眠症是一种睡眠障碍，病理生理学提示睡眠和清醒期间过度觉醒。其具体表现为：睡眠和清醒期间全身代谢率升高、睡眠早期皮质醇和促肾上腺皮质激素升高、心率变异性副交感神经张力降低及非快速眼动睡眠期间高频脑电图活动增加[26]。治疗失眠症主要以相关化学药物为主，具有较多的副作用，利用中国传统药材治疗失眠症，具有独特的低毒性、低副作用及低成瘾性等优势，故本文选取酸枣仁、夜交藤、柏子仁进行联合研究。

本研究通过构建PPI网络，发现酸枣仁、夜交藤、柏子仁治疗失眠症的核心靶点为过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、雌激素受体1 (ESR1)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)。有研究表明PPARG基因与中国汉族人群中阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的发病率有关[27]。ESR1可传导雌激素信号，夜交藤可能通过影响机体雌激素水平而阻碍睡眠调节相关的神经递质传导[21]。其中PTGS2也参与炎症水平调节来影响睡眠周期[28]。通过构建“中药–活性成分–疾病靶点”网络图，筛选出酸枣仁、夜交藤、柏子仁治疗失眠症的重要活性物质，谷甾醇(sitosterol)、植物甾醇(phytosterol)、槲皮素3-O-阿拉伯糖甙(quercetin-3-O-arabinoside)。有研究表明，β-谷甾醇具有抗炎、抗多种癌症、抗氧化等药理作用，且毒性较低[29]。植物甾醇与动物胆固醇分子结构高度相似，是一个由四环类甾醇母核结构和位于C-17位侧链组成的三萜化合物，具有抗癌、消炎、神经保护等药理作用[30]。槲皮素3-O-阿拉伯糖甙是一种黄酮类物质，具有广泛的抗炎、抗病毒、抗氧化及抗菌等特性，具有低毒性[31]，可作用于镇静，促进睡眠等。有研究表明睡眠质量与炎症有关[32]。故酸枣仁、夜交藤、柏子仁治疗失眠症与其中重要活性物质谷甾醇、植物甾醇、槲皮素3-O-阿拉伯糖甙等的抗炎特性、抗氧化能力、抗癌作用有关。

KEGG信号通路结果分析显示酸枣仁、夜交藤、柏子仁作用于失眠症的靶点主要涉及到PPAR信号通路、代谢途径、cAMP信号通路、5-羟色胺能突触通路以及胰岛素抵抗通路等。其中，PPAR可直接作用，可以通过调节靶基因的表达产生生物效应，通过抑制或激活来调节基因表达，或可影响着生物节律的调控[33]。有研究表明cAMP是胞内的第二信使，cAMP能够通过PKA-cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和Epac等信号通路，参与睡眠、昼夜节律调控和学习记忆等多种功能[34]。另有研究表明，5-羟色胺(血清素)对情绪、睡眠、消化和脑功能起着重要的作用[35]，胰岛素抵抗与睡眠时间及睡眠呼吸暂停有关，可干扰睡眠[36][37]。

β-谷甾醇可降低脂肪变性和甘油三酯，转氨酶(ALT和AST)和炎症标志物(IL-1β和iNOS)的血清水平[38]。此外，β-谷甾醇通过阻止肌醇需求酶-1 (IRE-1α)、X-box结合蛋白1(sXBP1)和C/EBP同源蛋白(CHOP)基因的过表达来降低内质网应激，以应对氧化应激。同时，β-谷甾醇可以通过减少抗氧化应激来增强遭受缺氧损伤的内皮细胞的活性，可减少神经元中胆固醇过多积累引起的细胞凋亡[39]。β-谷甾醇可以调节参与脂肪酸氧化过程调节的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-α)、甾醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)和肉碱棕榈酰转移酶-1 (CPT-1)。故β-谷甾醇可以通过抑制氧化应激、内质网应激和炎症反应，包括影响细胞周期、细胞凋亡、增殖等生理功能来治疗失眠症[38]。

植物甾醇及其氧衍生物通过抑制细胞增殖和转移、诱导细胞凋亡、改善免疫系统对癌症的识别、影响激素依赖性内分泌肿瘤生长和调节甾醇生物合成来发挥抗癌作用[40]。植物甾醇也具有抗炎作用，已知可消除一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、环氧合酶-2 (COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)的产生和激活[41]。植物甾醇具有穿过血脑屏障(BBB)并在大脑中积累的能力[42]。故植物甾醇可用于治疗失眠症。

槲皮素3-O-阿拉伯糖甙的抗氧化活性主要表现为对谷胱甘肽(GSH)、酶活性、信号转导途径和活性氧(ROS)的影响。通过调节抗氧化水平，例如调节A549细胞中抗氧化相关基因的表达来抑制氧化应激，防止抗氧化损伤[43]。因而槲皮素3-O-阿拉伯糖甙可保护大脑、神经或体内其他细胞免受氧化损伤，治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征[44]，从而治疗失眠症。

为了进一步探究各化合物与靶点作用情况，将此3个药物活性成分分别与3个疾病靶点蛋白进行分子对接初步验证。结果显示，靶点PTGS2与分子phytosterol的结合能最低，分子间稳定性最高，结合能为−10.52 kJ/mol。分子对接结果显示酸枣仁、夜交藤、柏子仁的关键活性成分与关键疾病靶点都有较好的亲和力，验证了通过网络药理学寻找药物作用机制、活性成分及靶点预测的可靠性。

综上所述，酸枣仁、夜交藤、柏子仁可依靠其内含有的谷甾醇、植物甾醇、槲皮素3-O-阿拉伯糖甙等有效活性物质具有的抗癌、抗炎、抗氧化特性，作用于PPAR信号通路、cAMP信号通路、5-羟色胺能突触通路、胰岛素抵抗通路等通路，通过多种信号传导途径治疗失眠症。本研究通过网络药理学验证酸枣仁、夜交藤、柏子仁治疗失眠症的作用机制，为后续研发酸枣仁、夜交藤、柏子仁药物提供理论基础。

基金项目

珠海科技学院2021年大学生创新创业训练计划项目(No.202113684010)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献