1. 引言
随着新型杀菌剂的开发逐渐成为研究热点，天然植物源活性物质的探索受到了广泛关注。特别是中药材，因其显著的抑菌效果和较高的安全性而成为研究的焦点[1]。在众多药食两用植物中，蒺藜、八角茴香、蘑菇等因其广泛的分布和便利的取材条件，成为近期研究的重点[2]-[4]。
鱼腥草(Houttuynia cordataThunb.)作为药食两用植物的代表，其应用横跨临床、制药、生物发酵及食品等多个领域。研究表明，鱼腥草不仅具有抗炎、抗癌、抗衰老等多重药理作用[5]-[10]，而且其研究潜力巨大。鱼腥草中的活性成分，已被证实具有显著的抑菌活性，如其黄酮类成分，对核梭杆菌生物膜形成有着显著的抑制效果[11]，生物碱成分对RAW 264.7细胞系的半抑菌浓度达到了8.7 μmol[12]。
鱼腥草作为一种传统药材，在疾病预防和治疗方面显示出显著的潜力。然而，关于其对特定病原体如雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)的抑制效果及其作用机制，目前的研究还相对有限。针对这一研究空白，本研究旨在深入挖掘鱼腥草叶片中对雷尔氏青枯菌的抑菌活性物质，以期为新型农药的研发和创新提供潜在的化合物资源。
2. 实验材料与方法
2.1. 仪器与器材
于湖北省利川市(东经：108˚21'；北纬：29˚42')采集野生鱼腥草叶片，由湖北大学生命科学学院黄岚杰老师鉴定并确认，方法为五点取样法，采集叶片于−80℃保存。雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)采购自于上海迈瑞尔化学技术有限公司。
实验仪器包括：Spectra Max iD3酶标仪；Easysep-3030高效液相色谱仪；德国LABCONCO低温浓缩仪。
NA/NB培养基原材料、甲基正壬酮标品、红四氮唑、结晶紫染液于上海阿拉丁生化科技股份有限公司采购。
2.2. 试验方法
2.2.1. 鱼腥草叶片提取液的制备
将鱼腥草叶片洗净后晾干，将剪碎的叶片放入研钵中，加入无水甲醇/去离子水直至覆盖住叶片，使用研杵碾碎叶片，将鱼腥草叶片完全碾碎后使用移液枪吸取液体转移至1.5 mL离心管中，1500 rpm离心5 min，吸取上清得到甲醇/水提取液。
2.2.2. 培养基的制备
本次实验选用NA/NB培养基，根据实验需要计算所需药品的量，用天平称取，加入适量蒸馏水溶解药品，混匀后用蒸馏水定容至目标体积，再将pH调至中性，分装培养基，0.101 MPa压力条件下灭菌30 min。NA/NB培养基配方如下：
NA固体培养基：蛋白胨：10.0 g/L；牛肉浸膏：3.0 g/L；氯化钠：5.0 g/L；琼脂：10 g/L；pH：7.2 ± 0.2；25℃；
NB液体培养基：蛋白胨：10.0 g/L；牛肉浸膏：3.0 g/L；氯化钠：5.0 g/L；pH：7.2 ± 0.2；25℃。
2.2.3. 拮抗能力鉴定
在培养皿中倒入NA固体培养基，吸取200 μL雷尔氏青枯菌菌悬液(OD600≈ 1.0)均匀涂布至培养基表面。使用灭菌枪头打孔后垂直加入40 μL待测药剂(以药物溶剂作为对照)，按照如下公式计算待测药剂的抑菌效果。
(1)
式中r0为药剂组菌落半径，r为对照组菌落半径。
2.2.4. 抑菌物质提纯与结构鉴定
采用高效液相色谱分离抑菌物质。设定色谱条件，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；设计流动相A相为色谱级甲醇，检测波长为300 nm，柱温为38℃；设置洗脱程序，采用等度洗脱的方式，设定流速为1.0 mL/min。采用平板对峙法验证各个物质的抑菌能力。
对具有较强抑菌效果的物质使用核磁共振仪鉴定物质种类，结合核磁氢谱、碳谱、二维谱分析结果鉴定化合物结构以验证。
2.2.5. 体外抑菌实验
取无菌96孔板置于超净工作台上，在样品测试组每孔加入100 μL菌悬液和100 μL不同浓度的青枯雷尔氏菌抑菌液，阳性对照组每孔加入100 μL菌悬液和100 μL的无水甲醇溶液，空白对照组加入200 μL NB液体培养基。将96孔板以封口膜密封，于28℃条件下培养24 h，设定酶标仪在600 nm下测定各孔在不同时间段的吸光值。按照如下公式计算抑菌率：
(2)
2.2.6. 半抑菌浓度的测定
预先于96孔培养板中加入100 μL浓度为1 × 108CFU/mL的青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌液，试验组加入100 μL的不同浓度青枯雷尔氏菌抑菌液，使其各孔的终浓度依次为12.5 mL/L，25 mL/L，50 mL/L，100 mL/L，设置空白对照(50 μL青枯雷尔氏菌菌悬浮液 + 150 μL营养肉汤)和阴性对照(50 μL青枯雷尔氏菌菌液 + 50 μL无水甲醇 + 100 μL营养肉汤)，37℃培养24 h，利用酶标仪测定OD600值。
2.2.7. 运动性测定
在Tans-Kersten等人[13]的研究基础上，进行了轻微的修改。高压灭菌含0.3%琼脂的NB液体培养基，待培养基冷却至50℃后，试验组加入抑菌液使其终浓度分别为12.5、6.125、3.125、1.256 mL/L，对照组加入等量的无水甲醇，空白对照组则为不含MNK的NB培养基，轻轻摇匀并倒入相同规格的平板，试验中为排除培养基体积所产生的误差，需将培养基在试管中配置(20 mL/管)。待培养基凝固以后，分别吸取2.5 μL浓度为1 × 108CFU/mL的菌液接种至培养基表面，37℃温箱培养24 h，培养期间平板勿晃动，待培养结束后测量各菌落直径。
2.2.8. 趋化性测定
在杨姗姗等人的基础上[14]，对趋化实验方案进行修改。青枯菌采用NB液体培养基在28℃、180 rpm条件下培养12 h，6000 rpm离心5 min收集菌体，用等体积磷酸缓冲液(100 mmol/L，pH 7.0)重悬菌体。然后在内径为1 mm的灭菌毛细管中吸入不同浓度(0、1.56、3.13、6.25、12.5 mL/L)的青枯雷尔氏菌抑菌液，垂直放入含有青枯菌液的培养皿内，静置40 min，用注射器将毛细管内的液体移出，稀释为1 × 10−5后涂布于含有红四氮唑的NA固体平板上，30℃培养18 h后计数。每组处理3次重复，以无水甲醇为对照。
2.2.9. 被膜形成能力测定
使用Peeters等人[15]描述的结晶紫染色法，对青枯菌生物膜形成进行了评估，进行了一些小的修改。将浓度为1 × 108CFU/mL的雷尔氏青枯菌菌液按1%比例接种至含青枯雷尔氏菌抑菌液的NB液体培养基中，终浓度依次为100、50、25、12.5 mL/L。同时设置空白对照组阴性对照，充分混匀并吸取200 μL的混合液于无菌的96孔培养板中，每组均设3个重复孔，置于37℃温箱中培养24 h。待培养结束后，吸净孔中的液体，用无菌的PBS缓慢清洗3次后，置于温箱中晾干；待晾干后，每孔加入200 μL的甲醇溶液固定20 min，吸弃甲醇，室温晾干15 min；待干燥后，每孔加入1%结晶紫染液200 μL，染色30 min，弃去染液，用无菌水清洗3次，每孔200 μL，吸弃双蒸水后，轻甩培养板至其干燥。待完全干燥后，向各孔中加入200 μL的33%冰醋酸溶液并充分混匀，静置10 min后用酶标仪测定其OD600值。
2.3. 统计分析
使用R软件(v 4.2.2)进行统计学分析。数据至少来自三次独立的测量，统计分析采用单因素方差分析，P值小于0.05被认为是统计学上显著的。
3. 结果
3.1. 鱼腥草叶片提取物抑菌效果
采用平板对执法验证甲醇提取液和水提取液的抑菌效果，结果如图1所示，发现两组对照组和水提取液抑菌圈半径均为2.5 mm (抑菌圈大小即孔径大小，2.5 mm)，而甲醇提取液的抑菌圈半径达到8 mm (8.45，7.95，9.15 mm)，说明水提取液没有拮抗效果，而甲醇提取液抑菌率达到了69.05%。说明鱼腥草叶片抑菌物质溶于甲醇，故后续实验以鱼腥草叶片的甲醇提取液进行实验。
3.2. 鱼腥草抑菌物质HPLC分离与结构鉴定
对甲醇提取液进行HPLC分离结果表明，在前10 min内，共鉴定出11个色谱峰(图2)，将每个峰单独分离出验证各自的抑菌效果后，发现在3.298 min的单体化合物A溶液有较强的抑菌效果(抑菌圈半径为：10.10，9.17，12.11 mm，平均抑菌率>75%)。
Figure 1.Antibacterial effects of methanol extract and aqueous extract
图1.甲醇提取液和水提取液的抑菌效果
Figure2.High-performance liquid chromatography analysis of purification results
图2.高效液相色谱分析提纯结果
对纯品化合物A使用Bruker AVIII-600核磁共振仪进行红外图谱鉴定物质种类，并结合核磁氢谱、质谱分析结果鉴定化合物结构以验证。
该化合物的1H-NMR谱中显示(图3)存在16个脂肪族亚甲基氢质子信号δH 2.39 (t, J = 7.3 Hz, 2H, H-3)，1.43 (p, J = 7.3 Hz, 2H, H-4)，1.26 ~ 1.19 (overlapped, 8H, H-5, 6, 7, 8)，1.26 ~ 1.19 (overlapped, 2H, H-9)，1.29 ~ 1.24 (overlapped, 2H, H-10)。
通过HSQC谱(图4)确定它们对应的碳信号分别为δc 42.71 (C-3)，23.23 (C-4)，28.94 - 28.61 (C-5, 6, 7, 8)，31.34 (C-9)，22.13 (C-10)；存在6个甲基氢质子信号δH 2.05 (s, 3H, H-1)，0.85 (t, J = 6.7 Hz, 3H, H-11)，通过HSQC谱确定它们对应的碳信号分别为δc 29.58 (C-1)，13.89 (C-11)。该化合物的13C-NMR谱显示(图5)还存在1个酮羰基信号δc 208.21 (C-2)。
根据图6可以看出，结合HMBC谱中(图7)H-1与C-2，C-3的相关信号，H-3与C-4，C-5的相关信号，H-11与C-9，C-10的相关信号，推断该化合物的结构如式一所示：
通过以上分析，猜测该物质为甲基正壬酮(Methyl Nonyl Ketone)，对甲基正壬酮标品进行液相分析发现，在相同程序的条件下，甲基正壬酮标准品的出峰时间与化合物A一致，故此，我们确定，单体化合物A为甲基正壬酮(Methyl Nonyl Ketone, MNK)。
Figure3.Proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectrum of monomeric compound A
图3.单体化合物A的H谱图
Figure4.Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectrum of monomeric compound A
图4.单体化合物A的HSQC谱图
Figure5.Carbon-13 nuclear magnetic resonance (13C NMR) spectrum of monomeric compound A
图5.单体化合物A的C13谱图
Figure6.Planar structural diagram of monomeric compound A
图6.单体化合物A的平面结构图
Figure7.Heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) spectrum of monomeric compound A
图7.单体化合物A的HMBC谱图
3.3. MNK抑菌效果验证
3.3.1. 不同浓度的抑菌液对雷尔氏青枯菌生长的影响
采用96孔板技术评估青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌生长的影响。实验结果如图8所示，随着培养时间的延长，经青枯菌抑制剂处理的雷尔氏青枯菌吸光值(OD600)呈现显著下降趋势(ANOVA, P < 0.01)，表明青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌的生长具有显著的抑制作用。尤其在培养4小时后，抑制剂显著抑制了细菌的生长，而对照组的OD值基本保持不变。方差分析(ANOVA)进一步证实，培养24小时后，不同浓度的青枯菌抑制剂处理组与对照组相比，吸光值的下降具有显著统计学差异(P < 0.01)，进一步验证了青枯菌抑制剂浓度对雷尔氏青枯菌生长的影响。
Figure8.Effect ofralstonia solanacearuminhibitory liquid concentrations on bacterial growth
图8.不同浓度的青枯雷尔氏菌抑菌液对青枯菌生长的影响对比图
3.3.2. 半抑菌浓度(IC50)的测定
采用微量二倍稀释法测定了青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌的最小抑菌浓度，实验重复3次，按照公式(1)计算MNK抑菌率：
按照抑菌率的计算公式，分别计算抑菌液在不同浓度下的抑制效果，结果如下表1所示。
Table1.The antibacterial effects of MNK at different concentrations
表1.不同浓度MNK的抑菌效果
MNK浓度(mL/L) |
12.5 |
25 |
50 |
100 |
抑菌率(%) |
48.779 |
52.336 |
57.151 |
59.712 |
48.779 |
59.266 |
58.021 |
61.042 |
65.806 |
66.227 |
70.900 |
71.028 |
平均值 ± 标准差 |
54.4555 ± 8.027 |
59.276 ± 5.671 |
62.024 ± 6.286 |
63.928 ± 5.050 |
使用GraphPad Prism 8软件对MNK的抑菌效果进行拟合，计算IC50(菌体生长抑制率为50%时的药物浓度)。
通过软件拟合的方程如下：
(3)
其中x为药物浓度(mL/L)，y为抑菌率(%)。
通过GraphPad Prism 8软件计算，得出IC50= 3.883 mL/L，抑菌液浓度达到3.883 mL/L时，药物对雷尔氏青枯菌的抑制效果达到50%。
3.3.3. 青枯雷尔氏菌抑菌液对青枯雷尔氏菌运动性的测定
进一步研究了青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌运动性的影响。结果显示(图9)，经过24小时恒温培养后，青枯菌抑制剂显著降低了雷尔氏青枯菌的运动能力。随着抑菌剂浓度的增加，R. solanacearum迁移区的直径逐渐减小。尤其当抑菌剂浓度达到3.125 mL/L时，R. solanacearum的迁移区域直径明显缩小，而在6.125~12.5 mL/L范围内，未观察到明显差异。
3.3.4. 青枯雷尔氏菌抑菌液对雷尔氏青枯菌趋化性的测定
细菌会趋向有利化学物质而规避有害化学物质，有效的药物抑制剂不仅能抑制青枯菌的生长，还能改变R. solanacearum的分布，影响微生态的群落组成及时空分布。与对照组相比，药物处理后毛细血管中R. solanacearum的数量均下降(图10)，当浓度达到6.25 mL/L时，细菌数量显著降低(ANOVA, P< 0.05)，药物对R. solanacearum趋化作用的影响，说明了药物抑制剂具有影响微生态组成结构的可能，从而多方面抑制R. solanacearum。
3.3.5 .青枯雷尔氏菌抑菌液对雷尔氏青枯菌被膜形成能力的测定
在0、12.5、25、50、100 mL/L的药物抑制剂浓度影响下，培养24 h后检查R. solanacearum的生物膜发展情况，结果如表2所示，相较于对照组，药物抑制剂分别在不同程度上增加了生物膜的形成。具体来说，当药物抑制剂浓度为12.5 mL/L、25 mL/L、50 mL/L、100 mL/L时，各自提高了雷尔氏青枯菌1.69%、3.96%、13.80%、64.45%的生物膜形成能力。这些发现表明，药物抑制剂促进了R. solanacearum生物膜的形成，使得R. solanacearum形成生物膜保护自身。
Figure9.Motility assay results ofralstonia solanacearumat various inhibitory liquid concentrations
图9.不同浓度的青枯雷尔氏菌抑菌液对雷尔氏青枯菌运动性测定结果
Figure10.Chemotaxis assay results ofralstonia solanacearumat various inhibitory liquid concentrations
图10.不同浓度的青枯雷尔氏菌抑菌液对雷尔氏青枯菌趋化性测定结果
Table2.Exploration of the biofilm formation ability ofRalstonia solanacearumat different concentrations of MNK
表2.不同浓度MNK对青枯菌被膜形成能力探究
MNK浓度 |
0 (培养基) |
12.5 mL/L |
25 mL/L |
50 mL/L |
100 mL/L |
吸光值OD600 |
0.0766 |
0.0955 |
0.1298 |
0.2624 |
0.7971 |
0.0721 |
0.0740 |
0.0850 |
0.1131 |
0.6473 |
0.0999 |
0.1299 |
0.1572 |
0.2873 |
0.7379 |
平均值 ± 标准差 |
0.0829 ± 0.0122 |
0.0998 ± 0.0230 |
0.1225 ± 0.0317 |
0.2209 ± 0.0769 |
0.7274 ± 0.0616 |
4. 讨论
本研究集中探讨了鱼腥草叶片中的活性成分，并通过一系列系统的提取、分离及鉴定步骤，成功揭示了甲基正壬酮(MNK)作为其中的一种活性成分，对雷尔氏青枯菌(R. solanacearum)具有显著的抑菌活性。进一步的分析表明，MNK不仅能有效抑制R. solanacearum的生长，还能影响其运动性、趋化性，以及被膜形成能力。这些发现为开发针对植物病原细菌的新型生物防治策略提供了有价值的信息和潜在的候选化合物。
本研究中鱼腥草叶片的甲醇提取液实现了69%的抑制率，而在张丽的研究中[16]，鱼腥草叶片提取液对真菌的抑菌率均低于50%。这一结果可能由于细胞壁形成了一个坚固的外部屏障，从而对外源性胁迫具有较高的抗性。
经过系统的提取、分离与鉴定流程，鉴定出甲基正壬酮(MNK)为鱼腥草叶片中一种有效抑菌活性成分，MNK对烟草青枯病病原菌–雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)达到了75%的抑制效果，即使在较低浓度下(3.883 mL/L)也能实现R. solanacearum的半抑制效果，这进一步证明了挥发油在植物病原菌的防治中的潜力[17]。而且与张晓南等人[18]所研究的多种挥发油复合物相比，MNK作为单一成分在低浓度下展现出的高效抑菌特性，进一步探究发现，MNK可以降低R. solanacearum的运动性、趋化性，增加R. solanacearum被膜形成能力。这些特性为开发以MNK为基础的新型植物病原细菌生物防治策略提供了新的视角和潜在的应用途径。
5. 结论
本研究成功从鱼腥草(Houttuynia cordataThunb.)叶片中提取并鉴定出具有显著抑菌活性的物质——甲基正壬酮(MNK)，其对烟草青枯病病原菌雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)展现出高效的抑制效果，半抑菌浓度(IC50)低至3.883 mL/L。MNK不仅能有效抑制病原菌生长，还影响其运动性和趋化性，并促进生物膜形成，为开发新型植物病原细菌生物防治剂提供了潜在的候选化合物，为植物病害的生物防治策略提供了新的视角。
基金项目
中国烟草总公司重点科技项目(110202101047(LS-07))；
中国烟草总公司重点科技项目(110202201019(LS-03))；
湖北省烟草公司重点科技项目(027Y2022-023)。
NOTES
*通讯作者。