1. 引言
安酷杜鹃(Encore®azalea)为映山红亚属的常绿多季开花的园艺杜鹃品种系列，具有长势旺盛、抗逆性好、适应性较强等特点，是理想的盆栽和园林绿化植物，被誉为21世纪销售最好的杜鹃花类群 [1] [2] [3] 。‘王妃’(Rhododendron‘Empress’)为其市场销售的优秀重瓣品种，应用形式丰富多样，花期可持续半年之久。目前我国市场销售的安酷杜鹃缺少黄色花品种，而我国野生杜鹃花种质资源丰富，其中，黄杯杜鹃(Rhododendron wardii) [4] 为我国高海拔地区特有的野生杜鹃，具有花朵美丽，颜色鲜艳的特点，是百余种园艺杜鹃品种的母本 [5] 。尽管我国杜鹃花属植物资源丰富，但园艺品种在花色、花香、株型等方面还有待改良，通过跨亚属的远缘杂交，有利于综合不同亚属多样的优良性状，选育新的优良品种。
培育黄花常绿杜鹃品种已有众多研究，并且一直都是育种工作者的重要目标。有研究者利用开白花的喇叭杜鹃(Rhododendrondiscolor)和火红杜鹃(Rhododendronneriiflorum)杂交，选育出了较好的黄色品种；用白色或粉色的极大杜鹃(Rhododendronmaximum)和似血杜鹃(Rhododendronhaematodes)进行杂交，其后代中也出现了黄色花的植株 [6] 。由此可见，通过粉色的安酷杜鹃与其他黄色杜鹃杂交培育黄花品种的常绿杜鹃同样具有一定的创新性。
不过迄今为止，我国还未有学者通过杂交成功培育出优秀的黄花常绿杜鹃。一方面我国对杜鹃的现代化育种研究起步较晚 [7] ，另一方面，常绿杜鹃与不同属植物的属间杂交亲和性及其细胞学机理仍不完全明确，相关的受精障碍克服技术远未成熟。因此，探寻常绿杜鹃与黄色杜鹃杂交亲和性的相关机理研究尤为重要。本试验以安酷杜鹃‘王妃’为母本，以黄杯杜鹃为父本，进行远缘杂交亲和性研究，杂交组合同时存在生殖隔离与地理隔离，对于映山红亚属常绿杜鹃远缘杂交育种具有重要意义。同时，通过不同授粉方式克服杂交受精障碍，明确属间杂交亲和性及其细胞学机理，为培育黄花常绿杜鹃新种质、新品种奠定理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
供试材料为安酷杜鹃园艺品种‘王妃’和黄杯杜鹃，杂交亲本生长特性见表1。杂交育种试验于2023年7~10月在云南卉兴农业有限公司试验大棚(地理坐标：24˚95′E，102˚24′N)进行，父本黄杯杜鹃花粉采于云南省迪庆藏族自治州白马雪山。
Table 1. Basic characteristics of hybrid parents
表1. 杂交亲本基本特性
2.2. 试验方法
2.2.1. 花粉活力及萌发测试方法
采用MTT法 [8] 与离体萌发法 [9] 测定父本花粉活力，于体式显微镜下拍照记录(拍照倍数 × 10)，设置3组重复统计花粉染色率与萌发率，花粉统计总数 > 100粒。本试验中，由于‘王妃’雄蕊瓣化，无花药囊，故以同系列安酷杜鹃‘象牙白’(Rhododendron‘Ivory’)为对照组父本。
(1)
2.2.2. 杂交授粉方法及结果统计
开花当天进行去雄处理，早上8:00~11:00采用不同授粉方式开展人工授粉试验，每组授粉数量不少于50朵。授粉一个月后统计膨大率，三个月后统计坐果率，授粉六个月后采收成熟的果实。
主要授粉方法为：(1) 提前授粉法：在开花1 d~2 d进行授粉；(2) 常规授粉法：在开花4 d~6 d进行授粉；(3) 延迟授粉法：在开花8 d~12 d进行授粉；(4) 加热授粉法：花粉在40℃培养箱培养1 h后用于授粉。
(2)
(3)
(4)
2.2.3. 杂交种胚培养
将采集回来的杂交种子从果实取出后，50颗为一组，重复三次，避光浸泡于1000 ppm的赤霉素溶液中24 h后，转入超净工作台进行无菌播种试验。培养基配方为：MS培养基 + 2mg·L−1GA3+ 0.1 mg·L−1NAA + 7.5 g·L−1琼脂 + 30g·L−1蔗糖，播种一个月后统计种子萌发率。
(5)
2.2.4. 花粉管生长动态观察
在母本开花第5~6 d天，柱头分泌大量粘液时，对其进行人工授粉。采取授粉后8 h、1 d、2 d、4 d、7 d、8 d、10 d、12 d及14 d的柱头5~8个，放入FAA固定液(甲醛:冰醋酸:70%酒精 = 1:1:18)中保存于4℃冰箱待用。参照Williams等 [10] 的方法，取出待测柱头，70%酒精–50%酒精–30%酒精–蒸馏水逐级复水漂洗后，于4 mol·L−1NaOH、60℃培养箱中软化4 h。蒸馏水漂洗后于0.1%苯胺蓝染色液中避光染色24 h，染色完成后将子房纵切进行压片，并于荧光显微镜(徕卡MZ16)下观察、拍照。
2.3. 数据分析
数据统计使用Excel2016，SPSS26.0 (IBM，美国)进行单因素方差分析(one-wayANOVA)和最小显著差异法(LSD)进行多重比较。数据分析前，应对数据进行正态分布检验，并验证方差齐次性，数据同时满足正态性与齐次性后进行方差分析。显著性分析基于单因素方差分析和LSD多重比较(P < 0.05)，结果均以平均值±标准差表示。并使用GraphPad Prism 9.0绘制柱状图。
3. 结果与分析
3.1. 花粉活力测定结果
MTT染色液所测定的花粉活力高于花粉离体萌发法所测定的结果(图1)。从MTT染色法所测定的花粉活力结果来看，黄杯杜鹃花粉活力为84.97%；将花粉加热培养1 h后，其花粉活力无显著差异。而花粉离体萌发结果与染色结果差异较大，经花粉离体培养后，黄杯杜鹃活力较低，为39.55%；加热培养后花粉活力显著下降，为24.06%。‘象牙白’在两种测定方法下花粉活力相近，在70%左右。使用MTT法所测定的花粉活力在60%以上，离体萌发法测定结果在20%以上，可用于杂交授粉。
Figure 1. Results of pollen viability measurement
图1. 花粉活力测定结果
3.2. 不同授粉方式对‘王妃’杂交结实的影响
4种授粉方式对‘王妃’与黄杯杜鹃杂交结实特性的影响如表2所示。常规授粉方式的膨大率与坐果率均高于其他3种授粉方式，提前授粉方式均低于其他授粉方式，不适合用于‘王妃’的杂交育种中；常规与加热授粉方式坐果率最高，分别为47.06%与46.43%，该组合较适合这两种授粉方式。其对照组‘王妃’ × ‘象牙白’坐果率为85.29%，显著高于远缘杂交组合。在‘王妃’ × 黄杯杜鹃中，4种授粉方式对蒴果平均种子数影响较小，但坐果率较低的提前与延迟授粉方式，其种子千粒重相对更重，与对照组种子千粒重(0.044 ± 0.004 g)无显著差异。
将所获得的远缘杂交种子及其对照组种子进行无菌培养，种子萌发结果如图2。‘王妃’与黄杯杜鹃杂交后，其杂交种子均不萌发(图2(A))，单位种子不具有可育性；而对照组‘王妃’ × ‘象牙白’萌发率较高(图2(B))，为78.33%，显著高于远缘杂交组合。
Table 2. Hybrid fruiting and germination situation of Rhododendron ‘Empressand’ and R. wardii
表2. ‘王妃’与黄杯杜鹃杂交结实及萌发情况
注：A：“王妃” × 黄杯杜鹃；B：“王妃” × “象牙白”。
Figure 2. Results of hybrid seed embryo culture
图2. 杂交种胚培养结果
3.3. 花粉管生长动态观察
‘王妃’花粉管荧光观察结果如图3，‘王妃’ × 黄杯杜鹃授粉8 h后花粉粒在柱头大量萌发(图3(A)-8 h)，2 d后花粉管沿着柱头有序向下生长的同时出现大量胼胝质(图3(B)-2 d)，授粉4 d后花粉管成束生长到柱头二分之一处时花粉管逐渐减少(图3(A)-4 d)，授粉7 d后观察到少量花粉管到达子房，花粉管出现分支现象(图3(A)-7 d)，授粉后8 d观察到极少数花粉管进入胚珠(图3(A)-8 d)；授粉2个月后，杂交果实较小(图3(A))，整体坐果率不高，表明‘王妃’ × 黄杯杜鹃远缘杂交存在一定的受精前障碍。对照组‘王妃’ ב象牙白’花粉管生长速度较快，授粉8 h后花粉粒在柱头大量萌发(图3(B)-8 h)，2 d后花粉管成束向下生长到柱头二分之一处(图3(B)-2 d、图3(D)-1 d)，4 d后花粉管到达子房入口(图3(B)-4 d)，子房开始产生大量胼胝质，授粉7 d、8 d后观察到较多花粉管进入子房和胚珠(图3(B)-7 d、图3(B)-8 d)；授粉2个月后，杂交果实均较饱满(图3(B))，杂交组合坐果率高，授粉后能正常结实，且种子萌发率高。
注：图片均为放大10倍后的结果；A. ‘王妃’ × 黄杯杜鹃授粉后2个月，杂交果实较小；B. ‘王妃’ × ‘象牙白’授粉后2个月，杂交果实饱满；A-8 h~A-8 d。‘王妃’ × 黄杯杜鹃杂交组合授粉后8 h至8 d花粉管发育情况；B-8 h~B-8 d。‘王妃’ × ‘象牙白’杂交组合授粉后8 h至8 d花粉管发育情况。(pg.花粉粒；pt.花粉管；Ca.胼胝质；bpt.花粉管分枝现象)
Figure 3. Fluorescence observation of pollen tube growth in Rhododendron ‘Empress’ × R. wardiiandRhododendron ‘Empress’ × Rhododendron ‘Ivory’
图3. ‘王妃’ × 黄杯杜鹃及‘王妃’ ב象牙白’花粉管生长荧光观察
4. 讨论
在高等植物的有性生殖中，植物花粉活力的高低与杂交授粉能否成功有着密切联系，明确父本的花粉活力是开展杂交育种的前提，也是避免杂交育种时因花粉活力较低而导致结实率低的重要技术措施 [11] 。目前测定杜鹃花粉活力的主要方法包括染色法与离体萌发法，其中染色法较为快速便捷，但易受花粉细胞完整性、酶活性和营养物质含量等的影响 [12] 。对于杜鹃花粉活力测定而言，MTT染色法是简单快速测定其活力的最适染色法 [13] 。相比之下，离体萌发试验只能用于测定成熟花粉的活力，且花粉萌发率受材料基因型、萌发培养基成分、温度和湿度等不同因素影响较大 [14] [15] [16] 。本研究中，MTT染色法所测定的花粉活力结果较离体萌发法偏高，其原因可能由于MTT染色液会使未成熟或已衰败的花粉粒着色。花粉经加热培养后，MTT染色法显示其活力无显著差异，该结果与杂交授粉数据一致。在离体萌发法中黄杯杜鹃花粉活力较低，可能与花粉离体培养时间有关，李斯宇 [17] 等对榴莲不同品种花粉离体培养发现离体培养8 h花粉活力最高，可适当延长培养时间加以验证。
亲和性是杜鹃花属植物育性研究的核心问题，判断杂交亲和性的直接指标是受精过程完成与否 [18] 。本研究选取坐果率及萌发率作为判定杂交亲和性的间接指标，分别体现了种胚的发育情况及其受精率 [19] 。试验中，‘王妃’与黄杯杜鹃杂交后，收获的杂交果实较小，虽能获得杂交种子，但种子不萌发，杂交组合为不育型。根据荧光观察可知，少部分花粉管能进入子房完成受精，但其种胚不能萌发，可能其发育后期出现胚及胚乳降解等现象导致其种胚不能正常萌发。
在高等植物中，花粉萌发和花粉管生长对开花植物的有性生殖至关重要，植物双受精前的任何失败都属于受精前障碍 [20] 。荧光显微技术是一种相对快速、可靠的鉴定植物杂交不亲和的方法，它是对花粉管在雌蕊中生长过程进行观察 [21] 。在本试验中，根据花粉管荧光观察结果可知，‘王妃’ × 黄杯杜鹃杂交后存在一定的受精前障碍，仅少部分花粉管进入子房完成受精；受精2 d后，柱头内部产生大量胼胝质，阻碍其花粉管继续向下生长，授粉后4 d，向下生长的花粉管减少，最终仅极少数的花粉管进入胚囊。同时，通过观察发现，与不亲和的花粉管中所积累的大量胼胝质相反，对照组花粉管表现出小的、断续的、大间距胼胝质塞，因而花粉管生长迅速，且大量花粉管进入胚珠完成受精。
5. 结论
MTT染色法测定黄杯杜鹃花粉活力结果偏高，为84.97%；而花粉离体培养结果仅为39.55%，且加热培养后花粉活力显著下降。
本试验所用的4种授粉方式均不能有效克服‘王妃’ × 黄杯杜鹃的受精前障碍，常规与加热授粉方式坐果率较高，分别为47.06%与46.43%。
通过荧光观察发现，‘王妃’ × 黄杯杜鹃杂交后产生大量的胼胝质，仅少量花粉管进入子房，存在一定的受精前障碍。同时，杂交种子均不能萌发，‘王妃’与黄杯杜鹃杂交后也存在一定的受精后障碍，远缘杂交组合极不亲和。
基金项目
云南省科技厅重大科技专项–云南重要园林木本花卉的种质关键技术研究(202302AE090018)
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。