1. 引言
黑色素瘤(恶性黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，是发病率增长最快的恶性肿瘤之一。在世界范围内，黑色素瘤每年约有23万例(1.7%)新发病例，并且约有5.5万例癌症死亡是由皮肤黑色素瘤引起的，占所有癌症死亡的0.7%。黑色素瘤在我国虽然少见，但近年来发病率也在成倍增长，且病死率高，黑色素瘤已经成为严重危及我国人民健康的疾病之一 [1] [2] [3] 。
对于黑色素瘤的治疗策略主要为手术切除和化疗，晚期黑色素瘤患者通常使用免疫疗法作为辅助治疗，如恶性黑色素瘤患者常规检测BRAFV600激活突变。三种BRAF/MEK抑制剂联合疗法被批准用于治疗BRAF突变阳性的不可切除或转移性黑色素瘤患者。除此之外，针对程序性细胞死亡-1受体及其配体(PD1-PDL1)的免疫检查点抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA4)抑制剂也常用于恶性黑色素瘤的治疗中。这些免疫疗法能够良好改善黑色素瘤患者的总生存率，但同时这些治疗方法仍然存在耐药性强、肿瘤复发率高等问题 [4] 。
临床上发现，黑色素瘤免疫疗法能够激活CD8 + T细胞，并且这些自身反应性CD8 + T细胞能有效识别黑色素瘤细胞，产生抗肿瘤免疫反应 [5] [6] 。越来越多的证据支持癌症免疫疗法诱导的CD8 + T细胞在黑色素瘤的预后中起着重要作用。因此，促进这些特异性CD8 + T细胞募集、增殖和效应子功能被视为增强黑色素瘤现有治疗效果的关键 [5] 。
Balood等人同样发现，黑色素瘤生长引发抗肿瘤免疫反应，包括效应CD8 + T细胞的浸润。黑色素瘤通过作用于组织内的伤害感受器神经元，使其释放免疫调节神经肽，如P物质(Substance P, SP)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide, CGRP)等 [7] 。有研究发现伤害感受器神经元释放的CGRP能够作用于黑色素瘤浸润效应CD8 + T细胞上的RAMP1受体，使肿瘤浸润效应CD8 + T细胞功能衰竭，从而利于黑色素瘤细胞不受抑制的增殖。使用选择性拮抗剂阻断CGRP对RAMP1的作用可防止效应CD8 + T细胞衰竭 [7] 。
SP是哺乳动物主要的速激肽(Tachykinin)之一，它与速激肽受体1 (Tachykinin Receptor 1, TACR1)，又称神经激肽受体(Neurokinin Receptor 1, NK1R)具有优先亲和 [8] 。NK1R介导SP参与许多生理功能的调节，并在病理条件下发生变化，使其成为多种疾病(神经退行性病变、酒精成瘾、疼痛、呕吐和癌症等)的重要靶点 [9] 。近几年的研究发现NK1R选择性拮抗剂阿瑞匹坦(Aprepitant, Apre)能够减少包括黑色素瘤细胞在内的多种肿瘤细胞的生长，但其具体作用途径仍然是未知的。基于以上，我们猜测，SP/NK1R信号轴可能有相似的作用，来调节黑色素瘤的生长。
本研究拟在C57BL/6小鼠上瞬时接种B16F10细胞形成原位黑色素瘤，同时耗竭CD4+调节性T细胞(regulatory CD4 + T cells, CD4 + Treg)，以更好的激活内源性自身反应性效应CD8 + T细胞靶向黑色素瘤细胞 [10] ，探究阻断SP/NK1R信号轴对黑色素瘤免疫的影响。
2. 方法
2.1. 供试试剂
阿瑞匹坦(MedChemExpress中国)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(南京生航生物技术有限公司)，胰酶细胞消化液(Biosharp)，InVivoMab anti-mouse CD4(Bio X Cell)，One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 594) (Elabscience)，0.9%氯化钠注射液(华仁药业股份有限公司)，Anti-Ki67抗体(abcam, ab15580)。
2.2. 供试细胞株
小鼠B16F10黑色素瘤细胞系，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2.3. 试验仪器与耗材
超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)，Cell 150型恒温培养箱(FUMA)，IX71倒置荧光相差显微镜(Olympus)，电子天平(美国，Sartorius)，立式自动压力蒸汽灭菌器(致微(厦门)仪器有限公司)，粘附型载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，游标卡尺(震坤行工业超市(上海)有限公司)，无菌胰岛素注射器(上海康德莱医疗器械股份有限公司)。
2.4. 供试动物
SPF级C57BL/6雌性小鼠，5周龄，体重20 ± 2 g，共40只，购于南京医科大学医药动物实验中心(许可证号：SCXK(苏)2021-0001)。动物饲养于中国药科大学药学动物实验中心普通设施和IVC环境中。饲养条件为室温20~25℃，湿度为60%，光照12 h循环一次，饮水和进食自由进行。
2.5. 试验方法
2.5.1. B16F10细胞的制备
将B16F10细胞冻存管从液氮中取出，其迅速放入37℃水中，在2 min内使其完全融化。将细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养，待细胞稳定培养三代后进行实验。在肿瘤细胞融合度到80%时，用DMEM培养基进行重悬、计数，将细胞浓度调整到1.6 × 103/μL，相当于每125 μL注射体积的最终2 × 105个B16F10细胞。
2.5.2. 小鼠接种原位黑色素瘤模型构建与给药
1) C57BL/6雌性小鼠适应一周后，根据体重随机分为正常组(Control)、空白组(Blank)、模型组(Model)和给药组(Apre)，每组10只小鼠。
2) 麻醉小鼠后，用剃须刀剔除右后背部毛发，使用胰岛素注射器通过皮内注射将125 μL的B16F10细胞注射到右侧皮肤，记录为第0天。
3) 第4天，在皮内注射部位用游标卡尺检查肿瘤大小。
4) 在第4天和第10天，测量小鼠体重并计算CD4 + Treg耗竭抗体(InVivoMab anti-mouse CD4)的剂量(10 μg/g小鼠体重)，腹腔注射递送CD4 + Treg耗竭抗体。
5) 从第4天起，测量小鼠体重并计算阿瑞匹坦的剂量(5 mg/kg小鼠体重)，腹腔注射递送阿瑞匹坦，每2天注射一次，直到第12天(共给药5次)。
6) 正常组仅同期腹腔注射等量生理盐水，空白组小鼠背部皮肤皮内注射等量B16F10细胞，不给予CD4 + Treg耗竭抗体，不给予阿瑞匹坦，仅同期腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。
2.5.3. 动物样本取材及处理
实验期间观察B16F10细胞接种后小鼠体重及肿瘤大小的变化情况等。末次给药24 h后(第13天)，脱颈处死小鼠，手术切除背部右侧黑色素瘤。用剃须刀剃掉黑色素瘤附近的毛发，在肿瘤根部切开皮肤将无菌剪刀的尖端插入切口部位，轻轻扩散到邻近区域，在附近皮肤和肿瘤之间形成一个解剖平面。暴露肿瘤后从粘连的深层组织中切除肿瘤，并保留适当的瘤周皮肤。剥离后立即浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h，后进行石蜡包埋。另外处死小鼠后，快速分离取小鼠脾脏和胸腺，剔除残余组织，并用滤纸吸干血渍，并称取质量。
2.5.4. 评价方法
使用游标卡尺测量原位黑色素瘤的最长径，原位黑色素瘤的生长变化值=末次给药24 h后肿瘤最长径(mm) − 第4天肿瘤最长径(mm)，并根据下列公式计算小鼠免疫脏器指数。
胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)；
脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)。
2.5.5. 免疫荧光染色
1) 石蜡包埋组织切成4 μm薄片，脱蜡、水化后，于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲溶液中进行抗原修复，维持92℃，15 min后停止加热，室温下冷却。
2) 使用封闭液，室温孵育1.5 h；
3) 滴加1:200稀释的Anti-Ki67抗体(abcam, ab15580)，放置于湿盒内，4℃过夜；
4) 移除抗体后，PBS清洗3次，每次5 min；
5) 滴加适当稀释的荧光二抗，室温避光孵育2 h；
6) 移除抗体后，PBS清洗3次，每次5 min；
7) 用DAPI染色液进行核染色，在室温下进行孵育30 min；
8) 用抗猝灭封片剂进行封片；
9) 荧光显微镜下观察。
2.5.6. TUNEL染色实验步骤
1) 组织切片脱蜡水化后，按照试剂盒说明书进行操作。每个样本上滴加100 μL 1 × 蛋白酶K工作液，37℃反应30 min；
2) 通透好的样本用PBS漂洗3次，每次5 min。
3) 每个样本滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，37℃湿盒中平衡30 min。
4) 吸水纸吸除TdT Equilibration Buffer。
5) 每个样本滴加50 μL标记工作液(含TdT Equilibration Buffer 35 μL + Labeling Solution 10 μL + TdT Enzyme 5 μL)，放入湿盒中37℃避光反应1 h。
6) 样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
7) 吸水纸吸干水分后滴加DAPI工作液，室温避光孵育5 min，对细胞核进行复染。
8) 样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
9) 用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。
10) 荧光显微镜下观察。
2.6. 统计学分析
采用GraphPad Prism 8.0软件对结果进行统计并做显著性分析。两组间差异采用T检验(T test)，多组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，p < 0.05代表在统计学上具有显著性差异。与空白组(Blank)相比，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，****p< 0.0001；与模型组(Model)相比，#p< 0.05，##p< 0.01。
3. 结果
3.1. 给予阿瑞匹坦拮抗NK1R对小鼠原位黑色素瘤增殖的影响
C57BL/6小鼠瞬时接种B16F10细胞形成原位黑色素瘤实验进程如图1所示。如图2所示，实验中正常组、空白组、模型组和给药组小鼠之间体重没有明显差异。如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠原位黑色素瘤的最长径增长显著减少(p< 0.05)；与模型组相比，给药组小鼠给予阿瑞匹坦后，其背部的原位黑色素瘤最长径显著缩短(p< 0.001)，表明给予阿瑞匹坦抑制NK1R后，小鼠原位黑色素瘤的增殖受到明显抑制。
Figure 1. Experimental flow chart of C57BL/6 mice transiently inoculated with B16F10 cells to form melanoma in situ
图1. C57BL/6小鼠瞬时接种B16F10细胞形成原位黑色素瘤实验流程图
Figure 2. Mouse body weight statistics (n = 6)
图2. 小鼠体重统计图(n = 6)
Figure 3. Statistical plot of changes in the longest diameter of in situ melanoma in mice (n = 6)
图3. 小鼠原位黑色素瘤最长径变化统计图(n = 6)
3.2. 给予阿瑞匹坦拮抗NK1R对小鼠原位黑色素瘤增殖和凋亡的影响
Ki-67是一种增殖细胞的相关抗原，其功能与有丝分裂密切相关。在临床上，阴性或低Ki-67增殖率与黑色素瘤良性诊断相关 [11] ，因此我们利用Ki-67免疫荧光考察各组小鼠原位黑色素瘤的体内增殖情况。如图4所示，模型组小鼠肿瘤组织Ki-67阳性率显著低于空白组小鼠(p< 0.001)；与模型组小鼠相比，给药组小鼠肿瘤组织的Ki-67阳性率显著降低，具有明显统计学差异(p< 0.01)；与空白组相比，给药组小鼠肿瘤细胞中Ki-67的表达更是显著降低(p< 0.0001)表明给予阿瑞匹坦拮抗NK1R能够显著抑制原位黑色素瘤的体内增殖率。
另外，我们利用原位末端转移酶标记技术(TUNEL染色)考察了肿瘤组织中细胞凋亡情况。细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡，伴随DNA双链的断裂，可以被脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)标记，生理状态下与细胞增殖之间维持动态平衡 [12] 。如图5所示，模型组小鼠与空白组小鼠之间肿瘤细胞凋亡无明显差异，但与模型组相比，给药组小鼠肿瘤组织中凋亡细胞比例显著增加(p< 0.05)，并且远高于空白组小鼠(p< 0.001)。表明抑制NK1R能够显著促进原位黑色素瘤细胞的凋亡，从而发挥抗肿瘤的效果。
Figure 4. Ki-67 immunofluorescence staining of in situ melanoma tissues in various groups of mice, scale = 200 μm
图4. 各组小鼠原位黑色素瘤组织Ki-67免疫荧光染色，标尺=200 μm
Figure 5. TUNEL staining of in situ melanoma tissues in various groups of mice, scale = 200 μm
图5. 各组小鼠原位黑色素瘤组织TUNEL染色，标尺=200 μm
3.3. 拮抗NK1R对小鼠原位黑色素瘤组织中免疫细胞的影响
进一步地，我们验证了拮抗NK1R所引起的肿瘤细胞增殖减少和凋亡增加是否与原位黑色素瘤组织中免疫细胞状态相关。胸腺和脾脏是调节机体免疫功能的重要器官。胸腺不仅作为T淋巴细胞发育的场所，还分泌胸腺素和促胸腺生成素等激素，与T淋巴细胞的发育、分化和成熟密切相关。脾脏是人体最大的淋巴器官，它具有产生淋巴细胞、净化血液和储存白细胞等功能，故胸腺指数和脾脏指数是衡量机体免疫功能的重要指标。一般情况下，机体受不良刺激后，其胸腺指数和脾脏指数会下降，反映机体免疫功能降低 [13] 。如图6所示，与正常组相比，空白组、模型组和给药组小鼠的脾脏指数有下降趋势，但未表现出显著性差异；给药组给予阿瑞匹坦后未能改善此情况。但如图7所示，与模型组相比，给药组小鼠的胸腺指数显著升高(p< 0.01)。这提示给予阿瑞匹坦拮抗NK1R后可能会使淋巴细胞增殖程度增加。接着，我们利用免疫荧光考察各组小鼠肿瘤组织中CD8 + T细胞的表达情况。如图8所示，与空白组相比，模型组小鼠在耗竭CD4 + Treg细胞后，肿瘤浸润CD8 + T细胞数目增加(p< 0.05)。与模型组相比，给药组小鼠在给予阿瑞匹坦后，肿瘤微环境中的CD8 + T细胞数目显著增多(p< 0.01)，并远高于空白组小鼠。同时，这些CD8 + T细胞不仅仅位于肿瘤侵袭边缘，而且也有效浸润了黑色素瘤。结果表明拮抗NK1R能够使宿主招募更多的CD8 + T细胞浸润，以增强抗肿瘤免疫的能力。
Figure 6. Statistical graph of spleen index of mice in each group (n = 6)
图6. 各组小鼠脾脏指数统计图(n = 6)
Figure 7. Statistical graph of Thymus index of mice in each group (n = 6)
图7. 各组小鼠胸腺指数统计图(n = 6)
Figure 8. Cytotoxic CD8 + T cell infiltration in situ melanoma tissues of mice in each group, scale = 200 μm
图8. 各组小鼠原位黑色素瘤组织中细胞毒性CD8 + T细胞浸润情况，标尺=200 μm
4. 讨论
NK1R拮抗剂以计量依赖的方式阻断SP与NK1R结合，可用于产生止痛、抗抑郁、抗焦虑和止吐作用，并可用于治疗尿失禁 [14] 。近几年的研究发现，阿瑞匹坦可以抑制肿瘤细胞的生长，加之其在安全性、特性等方面的研究，这让其成为癌症治疗的一个重要抓手 [15] 。研究发现，在结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝母细胞瘤、和神经母细胞瘤癌细胞系中，通过药物阻断NK1R信号，可以抑制肿瘤细胞生长，在肿瘤小鼠上给予NK1R拮抗剂，可以减少肿瘤增殖 [9] 。相似的，本研究证实了阿瑞匹坦能够有效抑制体内黑色素瘤细胞的增殖，并促进其凋亡。
本研究通过在C57BL/6小鼠上瞬时接种B16F10模拟早期黑色素瘤在浅表部位的状态，并通过耗竭CD4 + Tregs，更好的激活内源性自身反应性细胞毒性CD8 + T细胞。在最新的PD-1阻断治疗黑色素瘤的研究中发现，PD-1阻断发挥治疗作用与肿瘤和血液中存在多克隆CD8 + T细胞有关 [16] 。针对黑色素瘤的免疫疗法的成功反应取决于肿瘤微环境的免疫组成。肿瘤浸润免疫细胞，特别是肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)的数量、定位和表型是疾病进展的关键调节因子。TILs的作用主要包括了：1) 识别并攻击肿瘤细胞发挥抗肿瘤效应，如活化的CD8 + T细胞和自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK)主要发挥此效应；2) 保持免疫系统的平衡，防止免疫系统的过度反应，如Tregs。但在肿瘤微环境中，Tregs可能过度抑制免疫应答，从而促进肿瘤的免疫逃逸 [17] 。研究发现，Tregs的减少能够导致内源性自身反应性CD8 + T细胞逃避无能 [10] 。并且，不少研究认为SP与NK1R的相互作用能够活化ERK1/2的核转位，而ERK1/2在黑色素瘤模型中能够促进免疫逃逸，因此，靶向SP/NK1R信号轴也可能有利于增强抗肿瘤免疫 [18] 。基于以上，耗竭荷瘤小鼠的CD4 + Tregs能够更加直观地观察SP/NK1R信号轴对细胞毒性CD8 + T细胞的影响。实验结果表明，给予阿瑞匹坦拮抗SP/NK1R信号轴能够显著抑制黑色素瘤细胞在体内的增殖，并使其凋亡增加。而我们发现，该效应与肿瘤中细胞毒性CD8 + T细胞的浸润增加有关。然而阻断SP/NK1R信号轴是否影响了肿瘤浸润细胞毒性CD8 + T细胞的表型和效应功能仍需进一步研究。
本研究为更好的理解SP/NK1R信号轴对肿瘤免疫的调节作用提供了新的思路，为NK1R拮抗剂抗肿瘤的应用提供了参考，也为黑色素瘤免疫治疗抵抗提供了新靶点的思考。
5. 结论
给予阿瑞匹坦阻断SP/NK1R信号轴，能够通过增加肿瘤组织中效应CD8 + T细胞的浸润来显著抑制黑色素瘤细胞在体内的增殖能力，并有效促进其凋亡，从而增强机体抗肿瘤免疫。
NOTES
*通讯作者。