1. 引言
1.1. SHP2的功能
非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶No. 11 (简称：SHP2)，由位于人第12号染色体上的PTPN11基因编码而成 [1] ，SHP2是一种在动物体内普遍表达的酪氨酸磷酸酶(PTP)，在生命过程中，SHP2作为酪氨酸磷酸酶的一种，通过与相应的酪氨酸激酶共同调控蛋白酪氨酸残基的可逆磷酸化来完成相关的信号转导，如RAS-MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB等诸多关键的信号通路，从而控制细胞增殖、分化、迁移和死亡等一系列生命过程 [2] 。其结构上通过特定序列或接头蛋白(如GAB1-3、FRS-2、IRS1-4等)与SHP2的两个SH2结构域上的特定位点相互作用并识别，使得SHP2从低活性自抑制构象转变为高催化活性开放构象，并进一步识别下游特异性底物进行去磷酸化，完成整个信号转导过程 [3] 。
1.2. SHP2与肿瘤
SHP2的编码基因在PTP家族中率先被认定为原癌基因，SHP2蛋白也是PTP家族中目前唯一被证实的原癌蛋白 [4] ，是明确的癌症治疗靶标，在发育障碍努南综合征(50%) [5] 和各种癌症类型中，都发现了SHP2的突变导致活性过度激活，高活化的SHP2使得白血病、胃癌和乳腺癌的发生率增大 [6] [7] [8] [9] ，而且，SHP2与PD-L1/PD-1信号通路相关，可抑制T细胞活化，这也使它成为肿瘤免疫治疗的潜力靶点(如图1所示)。因此，对于SHP2小分子抑制剂的开发，已成为当下热点。
Figure 1. Activation of SHP2 protein
图1. SHP2蛋白的激活
1.3. 三氮唑衍生物
三氮唑衍生物属五元杂环化合物，环上有三个N原子，因此其配位形式多样，兼备有吡啶和咪唑的特点，对金属离子的络合及氢键作用力比较强，是很好的有机配体 [10] 。近年来，1, 2, 4-三氮唑衍生物凭借其独特的结构特性，可以结合生物系统中各种受体，如磷酸酶，具有抗肿瘤 [11] 、抗疟疾 [12] 、抗病毒 [13] 及抗真菌 [14] 等多种生物活性(如图2)，已有多个含1, 2, 4-三氮唑药效团的化合物处于临床前评价或临床试验阶段。因此，对1, 2, 4-三氮唑衍生物的合成研究及活性筛选，具有重要的意义。
图2. 三氮唑衍生物的化学结构
2. 实验
2.1. 仪器与试剂
AB54-S精密电子天平(METTLER TOLEDO)；DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州科泰实验仪器设备有限公司)；R-1001旋转蒸发仪(郑州长城科工贸易有限公司)；SHK-Ш循环水式多用真空泵(郑州科泰实验仪器设备有限公司)；ZF-6三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；AVENCE III/400 MHZ核磁共振仪(BRUKE, German)；−80℃低温冰箱(SANYO)；电动移液器(Thermo Scientific)；Envision多功能微孔板酶标仪(Perkin Elmer)；AKTA Avant蛋白纯化仪器(通用公司)。
苯甲酸(98%，上海毕得医药科技有限公司)；二氯亚砜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N, N-二甲基甲酰胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；石油醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；1, 4-二氧六环(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氨基胍碳酸盐(98%，上海毕得医药科技有限公司)；四丁基溴化铵(TBAB) (98%，上海毕得医药科技有限公司)。Tris Base、NaCl、丙三醇(甘油)、Tween-20、EDTA、乙酸铵、MnCl2等普通化学试剂系国产分析纯试剂(AR级)，二硫苏糖醇(DTT)购自上海生工生物有限公司；二甲亚砜DMSO (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
2.2. 化合物a-j的合成通法
将10 g化合物苯甲酸1a (82 mmol)加入至100 ml圆底烧瓶中，加入40 mL二氯甲烷和8.0 mL氯化亚砜(100 mmol)，缓慢加入N, N-二甲基甲酰胺(DMF) 4滴，加热回流过夜，反应完毕后，反应液减压蒸发后直接投下一步。取圆底烧瓶(250 mL)，加入氨基胍碳酸盐(13.6 g，100 mmol)，用1, 4-二氧六环(100 mL)溶解，放置在冰水浴中搅拌5 min，使反应物充分溶解混匀。再加入TBAB (1.6 g, 5 mmol)至烧瓶中，然后在体系中逐滴加入化合物苯甲酰氯1b (7.03 g, 50 mmol)，置于室温下搅拌，保持反应12 h，反应完毕后，使用旋转蒸发仪除去溶剂。将烧瓶内残余物溶于水(75 mL)，室温下搅拌混匀，用NaOH水溶液调pH至12，有白色固体析出，过滤干燥后得到化合物2-苯甲酰肼-1-甲脒1c (7.93 g, 89.1%)。取圆底烧瓶(250 mL)加入7.93 g的1c，加入50 mL水溶解，放置100℃油浴锅加热搅拌过夜。反应完毕后有大量白色固体析出，抽滤干燥后得到产物5-苯基-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺a (7.05 g, 98.9%)。
化合物b-j的合成方法与化合物a相同(如图3)。
图3. 化合物a-j的合成路线
2.3. 化合物的结构表征
表征数据
5-苯基-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(a)：白色固体，收率为：98.9%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.09 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 5.94 (s, 2H)。
5-(3-吡啶基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(b)：白色固体，收率为：94.5%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.18 (s, 1H,), 9.04 (s, 1H), 8.53 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 4.8, 2.8 Hz, 1H), 6.14 (s, 2H)。
5-(2-呋喃基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(c)：红色固体，收率为：95.6%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.05 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.67 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 2.8, 1.6 Hz, 1H), 6.04 (s, 2H)。
5-(2, 3-二氯苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(d)：红色固体，收率为：98.1%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.24 (s, 1H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.11 (s, 2H)。
5-(3-硝基苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(e)：黄色固体，收率为：95.3%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.29 (s, 1H), 8.63 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.28 (m, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 8.19 (m, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.20 (s, 2H)。
5-(间甲苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(f)：黄色固体，收率为：70.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.99 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.26 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.99 (s, 2H), 2.33 (s, 3H)。
5-(3-甲氧基苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(g)：红色固体，收率为：97.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.08 (s, 1H), 7.52 -7.43 (m, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.30 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.93 (s, 2H), 3.78 (t, J = 1.6 Hz, 3H)。
5-(3-氯苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(h)：白色固体，收率为：97.7%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.93~7.73 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 6.06 (s, 2H)。
5-(3-溴苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(i)：红色固体，收率为：97.7%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.15 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.93~7.77 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.10 (s, 2H)。
5-(4-溴苯基)-4H-1, 2, 4-三氮唑-3-胺(j)：白色固体，收率为：95.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.11 (s, 1H), 7.98~7.71 (m, 2H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.07 (s, 2H)。
2.4. 化合物的生物活性评价
应用大肠杆菌系统克隆表达GST-SHP2融合蛋白，经过GSH-Sepharose亲和层析分离得到纯化的GST-SHP2蛋白。通过实验表明蛋白酪氨酸磷酸酯酶SHP2与融合形式的GST-SHP2有相似的酶学特性。应用大肠杆菌表达系统表达GST-SHP2催化结构域，以GST融合蛋白形式存在于上清，细胞裂解后经GSH-亲和柱纯化，获得融合蛋白进行GST-SHP2抑制剂的活性筛选。
对合成得到的10个1, 2, 4-三氮唑类衍生物进行体外SHP2分子活性评价，应用大肠杆菌系统克隆表达GST-SHP2融合蛋白，荧光底物为DIFUMP，在384孔黑色微孔板(OptiPlate-384, Perkin Elmer)中检测酶活性，先加入SHP2蛋白(终浓度为2 nM) 20 μL，其中SHP2蛋白先与10 μl检测化合物在25℃条件下共孵育15 min，后加入底物DiFMUP，终浓度(10 μM) 20 μL起始反应，反应体系终体积为50 μL，DMSO [1% (v/v)]，使用酶标仪(Envision)检测激发/发射波长340/450 nM通道信号值，通过计算得到反应初速度。加入合成的1, 2, 4-三氮唑类衍生物，通过观察荧光强度变化反映酶活性的变化，进而得到不同化合物对蛋白酶的抑制情况。
3. 结果与讨论
3.1. 化合物生物活性测定结果
Table1. Compound biological activity results
表1. 化合物生物活性结果
3.2. 化合物生物活性结果分析
表1汇总了评价1, 2, 4-三氮唑衍生物对SHP2的抑制活性数据，有8个化合物是苯环取代的，在这8个化合物中，我们发现，引入给电子会使化合物对SHP2的抑制活性降低；而引入吸电子对SHP-2PTP的抑制率的情况是复杂的，如间位引入硝基后，化合物5e对SHP2的抑制活性增强；引入卤素原子后，化合物4d，8h，9i，10g对SHP2的抑制活性减弱，这可能因为硝基电负性卤素原子大，与SHP2活性位点区域更容易结合。而杂环取代的化合物中，吡啶环取代的化合物2b比呋喃环取代的化合物3c的抑制活性要强。遗憾的是，这类化合物的抑制活性较低。
4. 结论
本文为拓展SHP2抑制剂结构的多样性，设计并合成了10个1, 2, 4-三氮唑衍生物，利用核磁共振氢谱对其进行了表征，并对其进行生物活性评价，构效分析表明，苯环上强吸电子的引入对生物活性有重要的影响，而杂环的替代对化合物产生一定的影响。这是一类全新骨架的SHP2小分子化合物，该类化合物分子量小，易于衍生化，为后续作为活性片段开发更多的SHP2抑制剂提供了重要的基础。