1. 引言

硒元素是植物生长的必需元素，SeNPs能够提高植物的营养品质，在农作物的生长过程中添加适量的SeNPs能够提高谷物中的糖和粗蛋白 [1] ，提高水培生菜茎叶的产量，以及还原糖、总糖、叶绿素和维生素C的含量 [2] [3] 。在喷洒了SeNPs的番茄，鹰嘴豆及西兰花植株的种子中，黄酮类化合物的含量都显著高于没有喷洒SeNPs的对照组 [4] [5] ；此外，SeNPs还能提高紫莴苣花青苷的含量 [6] 。当植物受到病原菌的侵害时，通常会产生活性氧(ROS)自由基从而导致细胞膜以及膜上的蛋白质等大分子物质遭到破坏。SeNPs是许多抗氧化酶的重要组成部分，如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶，并且SeNPs还能提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶的活性；因此，硒参与了体内氧化还原反应，清除脂质过氧化物等自由基，从而防止植物细胞受到氧化损伤 [7] [8] 。综上，SeNPs可以通过调节植物的光合作用、促进植物生长、提高植物体抗氧化酶活等来增强植物的抗逆性。植物黄萎病主要是由大丽轮枝菌等所引起的植物根、枝、叶等植物维管束病害。此病原菌通过危害植物维管束，对植物的株高、果实的生长产生严重影响 [9] 。这种病害对于棉花这种重要的经济作物来说就是“癌症”一般的存在，它会致使棉花大幅减产，棉蕾大量脱落，严重可致其全株死亡，难以控制 [10] 。在此，本研究首次利用五味子植株体内分离出的高浓度亚硒酸钠耐受菌SRB6生物合成SeNPs，研究SeNPs的促生作用以及体外抑菌性；再利用大丽轮枝菌对棉花幼苗进行处理，探讨SeNPs对植株抗病的影响以及相关的抗氧化机理。本研究旨为SeNPs在植物抗病中的应用提供一定的理论基础。

2. 材料方法

2.1. SeNPs的制备与表征

从北五味子中分离出高浓度耐受的霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)菌株SRB6接种于5 mM亚硒酸钠的培养基中(1%, v/v)；于37℃、pH 7、150 rpm下培养48 h。培养结束后10,000 g离心10 min。沉淀采用0.9% (w/v) NaCl洗涤3次，再将其重悬于20 mL Tris-HCl缓冲液(50 mM, pH 8.2)中。然后，将重悬液超声10 min。10,000 g离心30 min分离破碎细胞后；再22,500 g离心30 min收集纯化的SeNPs；超纯水洗涤2次后重悬于去离子水中。样品经过冷冻干燥后用扫描电子显微镜观察。

2.2. SeNPs体外抗菌活性

将V. dahlia生长状况良好的培养基，用5 mm的打孔器沿着菌落的边缘取下菌饼，分别接种于不同浓度纳米硒(5、25、50 mg/L) PDB培养基中，并将菌株接种在不含纳米硒颗粒的培养基上作为对照组。在黑暗条件下28℃、150 rpm、培养14天后，取出烘干称重。

2.3. 植物促生研究

将健康棉花种子消毒 [11] ；之后将其种植在花盆中；在25℃、8000 lux光照16 h、黑暗8 h条件下培养。待植株长成为大小均匀的幼苗后(4~5片完整叶子)，移栽至花盆中。以叶片不喷洒SeNPs的植株作为对照组，实验组植株叶片分别喷洒不同浓度的亚硒酸钠或SeNPs；每组五个重复，每1~2天重复喷洒一次。在25℃、光照16 h/d的培养箱中培养。每两天浇一次无菌水以保证土壤湿度。45天后拍照并测量生长指标。

2.4. 植株抗病测试

配制浓度为1 × 10⁷mL⁻¹的V. dahlia孢子悬液。将实验组幼苗的根部浸入其中3 h；随后移栽到花盆中。其中，对照组不经悬液处理，也不添加纳米硒颗粒；实验组幼苗经过孢子悬液浸根处理，叶片分别喷洒不同浓度的纳米硒颗粒(0、5、25和50 mg/L)。将植株置于25℃、光照16 h/d、相对湿度60%的培养箱中培养。每1~2天将孢子悬浮液接种于病原组和实验组的根部。每两天浇一次灭菌水以保证土壤湿度。待病原组植物叶片发生明显病变后，开始测定各组参数。

2.5. 生长指标测定

在处理45天后，收集棉花植株，并用蒸馏水清洗干净，使用滤纸吸干水分。测定植物根长、茎长、叶片数、鲜重，之后置于65℃烘箱烘干至恒重，测定植株的干重。

2.6. 叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定法参考了李合生的方法 [12] 。0.2 g叶片剪碎，放置于烧杯中，再加入10 mL丙酮和无水乙醇(1:1)混合液，放置在黑暗条件下24 h避光处理，待叶片变成白色时，用分光度计在663 nm和645 nm下测定吸光度值。利用公式1~4计算叶绿素含量。

$\text{Ca}=12.72\times \text{A}663-2.59\times \text{A}645$(1)

$\text{Cb}=22.88\times \text{A}645-4.67\times \text{A}633$(2)

$\text{C}\left(\text{a}+\text{b}\right)=20.30\times \text{A}645+8.04\times \text{A}633$(3)

$叶绿素含量\left(\text{mg}/\text{g}\right)=\left(\text{C}\times \text{V}\right)/\left(1000\times \text{M}\right)$(4)

C：叶绿素浓度mg/L；V：叶绿素溶液总体积mL，M：叶片鲜重g。

2.7. 脯氨酸含量测定

脯氨酸活性的测定法参照White的方法 [13] 。脯氨酸含量的测定方法如下：0.1 g新鲜叶加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液中，沸水浴10 min后冷却，4℃离心(10,000 rpm, 15min)。将2 mL的上清液、2 mL 2.5%茚三酮和2 mL冰醋酸混合，沸水浴1 h。冷却后加入4 mL甲苯萃取，取上层液体4℃离心(3000 rpm, 5 min)，在520 nm处测定吸光度，根据脯氨酸标准曲线计算植物脯氨酸的含量。

2.8. 活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定法参照李合生的方法 [12] 。过氧化物酶(POD)活性的测定法参照熊庆娥的方法 [14] 。过氧化氢(H₂O₂)水平按照Verma等人所述的方法测量上清液中的含量 [15] 。过氧化氢酶(CAT)活性与脯氨酸活性的测定法参照White的方法 [13] 。丙二醛(MDA)活性的测定法参照熊庆娥的方法 [14] 。还原性谷胱甘肽(GSH)采用阿米达生物科试剂盒测定。

2.9. 数据分析

所有的数据均用平均值 ± 标准差表示，用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较法(P < 0.05)等统计学分析。使用作图软件Origin 2021进行作图。

3. 结果与分析

3.1. SeNPs的表征

在自然界中，有许多细菌可以将亚硒酸钠的还原成具有一定大小和形状的硒纳米颗粒。本研究利用植物内生菌制备了SeNPs，由扫描电镜的结果图中可以看出(图1)，菌株产生纳米颗粒大小的单质硒，其呈现大小均匀的圆形。

3.2. SeNPs对病原菌的抗性

为了探究生物合成的SeNPs的抗菌潜力，在不同浓度SeNPs的培养基中接种大丽轮枝菌，并观察它的生长情况。结果如图2所示。与对照组相比，随着SeNPs浓度不断升高，病原菌在培养14天后，干重越来越低。由此可知，高浓度的SeNPs对病原菌的生长有抑制作用。

3.3. SeNPs的促生作用

如表1所示，SeNPs的应用提高了棉花的营养品质，包括根长、茎长、生长程度、鲜重和干重。这些生长指标也随着纳米硒(5、25和50 mg/L)浓度的增加而逐渐增加。并且，与对照组和亚硒酸钠处理组相比，50 mg/L SeNPs处理组的根茎长度、鲜重和干重均有显著增加。在不同的处理组中，叶片数量无明显变化。

相比于50 mg/L SeNPs处理组，其他低浓度的SeNPs对植物也有一定促进生长效果；说明了随着SeNPs浓度的不断增加，植物的生长越来越旺盛(图3(A))。同时，相比于亚硒酸钠处理组，低浓度的SeNPs对植物没有毒副作用，也不抑制植株生长。但随着亚硒酸钠浓度的不断增高(5、25和50 mg/L)，植物的生长也受到了一定的抑制作用，并且也出现了枯萎发黄现象(图3(B))。

3.4. SeNPs对叶绿色的影响

叶绿素是植物光合色素之一，它的含量可以有效的体现出植物生长状态。本研究测定不同浓度(0、5、25、50 mg/L)的SeNPs对接种V. dahliae棉花中叶绿素含量的影响；对照组不接种V. dahliae，也不经过SeNPs处理。由图4可以看出，随着SeNPs浓度的升高，处理组中叶绿素含量逐渐升高。相比对照组，50 mg/L SeNPs处理组的总叶绿素含量上升最为显著；SeNPs-0处理组的总叶绿素含量最低。五个处理组中，叶绿素b的含量变化相对较小。

3.5. SeNPs脯氨酸的影响

脯氨酸是植物受到逆境胁迫的信号；其可以保护植物免受环境胁迫和ROS的破坏作用。本研究检测不同浓度(0、5、25、50 mg/L) SeNPs对V. dahliae胁迫棉花植株中脯氨酸的影响；对照组不接种V. dahliae，也不经过SeNPs处理。结果如图5所示。随着SeNPs浓度的升高，脯氨酸的浓度逐渐降低。相比对照组，未喷洒SeNPs处理组(SeNPs-0)的脯氨酸含量最大，说明植物受到了大丽轮枝的胁迫，导致游离的脯氨酸大量累积。SeNPs-50处理组的脯氨酸含量相对较低，表明SeNPs缓解了病原菌对植株的胁迫作用。

3.6. SeNPs对抗氧化酶活的影响

CAT、GSH、SOD、POD是植物抗过氧化系统中主要的抗氧化酶；这些抗氧化酶可以有效地提升植物的抗逆境胁迫的能力，从而提高植物抵抗病原菌的能力；其中，H₂O₂与MDA是植物机体抗氧化的重要参数。

如图6(A)所示，在接种病原菌的处理组中，CAT含量随着SeNPs浓度的升高而升高。50 mg/L SeNPs处理组的CAT含量比SeNPs-0处理组(未经SeNPs处理)高出了83.67%；相比对照组降低了12.50%；这说明经过高浓度SeNPs处理的棉花植物具有较强的抵御病原菌侵害的能力。

如图6(B)所示，GSH的含量随着SeNPs浓度的升高不断升高。50 mg/L SeNPs处理组的GSH含量比未喷洒SeNPs的处理组(SeNPs-0)高出了46.63%；而5和25 mg/L SeNPs处理组的GSH含量分别高出 28.38%，32.72%。相比对照组，50 mg/L SeNPs处理组GSH含量仅降低20%。

从图6(C)可以看出，接种病原菌后，随着SeNPs浓度的升高，H₂O₂水平有着显著降低(P < 0.05)。50 mg/L SeNPs处理组的H₂O₂水平比未喷洒处理组(SeNPs-0)降低54.38%；而SeNPs的5和25 mg/L处理组分别降低24.56%，38.60%。对照组中H₂O₂的含量最低；与SeNPs-0处理组相比降低了64.91%。

如图6(D)所示，随着SeNPs浓度的升高，植株中MDA的含量逐渐降低。SeNPs-50处理组与对照组和未喷洒SeNPs (SeNPs-0)理组相比，MDA的含量分别降低5.84%和86.92%。在50 mg/L SeNPs的处理组中达到最低。SeNPs-0处理组的MDA的含量最高，达到了61.28 μmol/g样品。

如图6(E)所示，在接种相同量的病原菌条件下，随着SeNPs浓度的不断升高，植株体内POD的含量逐渐降低。未喷洒SeNPs时，植株在受到外源病菌胁迫后，导致POD的含量大幅上升；而对照组POD的含量最低。与SeNPs-0处理组相比，SeNPs-50处理组POD的含量降低了53.50%。

SOD在植物遇到外来病原菌的侵入时，起着保护酶的作用，以消除各种活性氧对生物体的危害。处理结果如图6(F)所示。未喷洒SeNPs处理组的SOD的活性与SeNPs-5、SeNPs-25、SeNPs-50处理组相比，分别降低了5.94%、16.37%和26.68%与对照组相比，SeNPs-50处理组的SOD的含量也仅降低10.65%。

4. 讨论

元素硒具有促进植株发育的效果 [16] ；此外，还具有抗氧化和抗菌作用 [17] [18] 。真菌细胞质膜的麦角甾醇在接触元素硒时，会导致质壁分离，从而产生抗菌作用 [19] 。本研究表明，SeNPs具有促进植物生长和抑制病原菌的效果。

亚硒酸钠是硒的一个来源，但超过一定浓度就会导致植物硒中毒，并造成细胞死亡 [20] 。例如，265~530 μmol/L的纳米硒能够显著促进烟草愈伤组织的生长，但同浓度下的亚硒酸钠却完全产生了抑制作用 [21] 。本研究喷洒不同浓度的亚硒酸钠溶液对植物的生长并没有起到促进作用，反而导致植物更易得病，且生长缓慢。然而相同处理的纳米硒随着浓度的升高，对植物的促生长作用越来越显著，叶绿素的含量远高于未喷洒SeNPs的处理组。

植株在受到病原菌侵染时，通常会产生ROS，但会导致植物体内大分子物质遭到破坏。SeNPs是许多抗氧化酶的重要组成部分，可以提高抗氧化酶的活性，从而防止植物细胞受到氧化损伤 [7] 。本研究棉花植株在喷洒不同浓度的SeNPs后，各项生理指标都发生了一定的变化。高浓度SeNPs处理下，脯氨酸与MDA的含量显著降低，这表明棉花植株耐受性得到了提高。接种病原菌的处理组，CAT、GSH、SOD等抗氧化酶的活性随着SeNPs浓度的升高不断提高，这表明SeNPs能够显著提高植株抵御自身氧化的机制，并且有效降低病原菌对植株的伤害。

5. 结论

本研究利用五味子内生菌合成SeNPs以用于棉花植株抗病。体外抑菌实验表明SeNPs对V. dahliae生长有一定的抑制作用。促生实验表明，亚硒酸钠理后的植株叶片枯萎发黄现象较为明显；根长、茎长、鲜重和干重较对照组显著降低。然而，随着SeNPs浓度不断升高，棉花的生长越来越旺盛；并且与对照组相比，根长、茎长、鲜重和干重显著提高。在受到病原菌胁迫时，SeNPs能够提高叶绿素含量，并降低植株体内脯氨酸浓度。抗氧化结果表明，随着SeNPs浓度的升高，患病棉花的抗氧化酶活性逐渐增大。相比对照组，50 mg/L SeNPs处理组的棉花叶片中CAT、GSH、SOD 显著提高了；并且H₂O₂、MDA、POD的活性随着SeNPs浓度的升高显著降低；因此，SeNPs可以提高植物体内的抗氧化酶活性，从而提高植株的抗病性。本研究为SeNPs在植物抗病中的应用提供一定的理论基础。

基金项目

重庆市教委科学技术研究项目(KJQN202204503)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献