摘要:目的：建立跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量测定方法。方法：以Agilent ZORBAXSB-C8柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相，检测波长为340 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃。结果：羟基红花黄色素A在40.2~201.0 μg/mL浓度范围内线形关系良好，r = 0.9995 (RSD = 1.6%, n = 5)，平均回收率为96.2% (RSD = 1.3%, n = 6)；阿魏酸在1.01~5.05 μg/mL浓度范围内线形关系良好，r = 0.9997 (RSD = 1.1%, n = 5)，平均回收率为98.6% (RSD = 1.5%, n = 6)。结论：本方法简便、准确，结果稳定，可用于跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的测定。
Abstract:Object: To establish a method for the determination of Hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in diedahuoxue powder. Methods: Agilent ZORBAX SB-C8 column (5 μm, 250 mm × 4.6 mm) was used as the chromatographic column, acetonitrile-0.1% phosphoric acid-tetrahydrofuran (18:80:2) as the mobile phase, the detection wavelength was 340 nm, the flow rate was 1.0 ml/min, and the column temperature was 30˚C. Results: The linear range of Hydroxysafflor yellow A was 40.2~201.0 μg/ml, r = 0.9995 (RSD = 1.6%, n = 5), the average recovery was 96.2% (RSD = 1.3%, n = 6); the linear range of Ferulic Acid was 1.01~5.05 μg/ml, r = 0.9997 (RSD = 1.1%, n = 5), the average recovery was 98.6% (RSD = 1.5%, n = 6). Conclusion: The method is simple, accurate and stable. It can be used for the determination of Hydroxysafflor yellow A and Ferulic Acid in diedahuoxue Powder.
1. 引言
跌打活血散现行质量标准收载于《中国药典》2020年版一部 [1] ，处方由红花，当归，血竭，三七，烫骨碎补，续断，乳香(炒)，没药(炒)，儿茶，大黄，冰片，土鳖虫等组成。方中红花、乳香、没药活血祛瘀止痛；血竭、三七、骨碎补、儿茶、土鳖虫活血疗伤；当归、续断养血活血，疗伤续折；大黄、冰片破瘀消积止痛。诸药合用，共奏舒筋活血，散瘀止痛之功效。临床上主要用于治疗跌打损伤，瘀血疼痛，闪腰岔气。现行质量标准仅规定了没药、乳香、血竭、红花、续断、大黄、土鳖虫的显微鉴别，大黄、当归、儿茶的薄层色谱鉴别及制剂通则检查，不利于该产品的质量控制，制剂处方中主成分当归，其有效成分均为阿魏酸，红花的有效成分为羟基红花黄色素A。本研究在参考大量文献资料的基础上 [2] - [12] ，采用高效液相色谱法同时测定跌打活血散中的羟基红花黄色素A和阿魏酸，同时控制成品中当归和红花的含量，可用于控制跌打活血散的质量，为其质量标准的提高提供依据。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
Agilent1200高效液相色谱仪(配DAD检测器)；Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)；BT125D电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；KQ100型超声波药品处理机(昆山市超声仪器有限公司)。
2.2. 试药
羟基红花黄色素A对照品(批号：111638-201810，中国食品药品检定研究院)，阿魏酸对照品(批号：110773-201614，中国食品药品检定研究院)，色谱乙腈(天津大茂化学试剂)，其他试剂均为分析纯，样品为市售，阴性样品为自制。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件与系统适用性试验
1) 色谱条件以Agilent ZORBAX SB-C8柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相，波长为340 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，进样量为10 μl。
2) 系统适用性试验理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000，羟基红花黄色素A和阿魏酸与相邻峰的分离度均大于1.5。
3.2. 溶液的制备方法
3.2.1. 供试品溶液的制备
取本品适量约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声提取25分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加50%甲醇稀释成10 μg/ml的溶液，即得。
3.2.2. 对照品溶液的制备
精密称取羟基红花黄色素A对照品和阿魏酸对照品，加50%甲醇制成每l ml含羟基红花黄色素A 80 μg和阿魏酸2 μg的混合溶液，摇匀，即得。
3.2.3. 阴性样品溶液的制备
按质量标准【处方】和【制法】项下的规定制备不加红花和当归的阴性样品适量，取约1.0 g，照“3.2.1.”项下方法操作，即得。
3.3. 专属性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“3.1.”项下色谱条件测定。结果表明，阴性样品中在与羟基红花黄色素A对照品和阿魏酸对照品保留时间相应的位置无色谱峰，说明处方中其他组分对测定无干扰，方法专属性好，选择性高。
3.4. 线性关系的考察
取羟基红花黄色素A对照品和阿魏酸对照品，精密称定，加50%甲醇制成含羟基红花黄色素A为40.2、60.3、80.4、120.6、201.0 μg/ml和阿魏酸为1.01、1.515、2.02、3.03、5.05 μg/ml的标准系列混合溶液，按“3.1.”项下色谱条件，分别取各浓度对照品溶液10 μl注入液相色谱仪测定，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，羟基红花黄色素A在40.2~201.0 μg/mL浓度范围内线形关系良好，阿魏酸在1.01~5.05 μg/mL浓度范围内线形关系良好，见表1~2。
Table 1. Results of linear relationship examination for hydroxysafflower yellow pigment A
表1. 羟基红花黄色素A线性关系考察结果
Table 2. Results of linear relationship examination of ferulic acid
表2. 阿魏酸线性关系考察结果
3.5. 精密度试验
按“3.2.1.”项下制备样品溶液，取同一供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件测定进样10 μl，连续进样5次，以峰面积计算，羟基红花黄色素A峰面积的RSD为1.2%，阿魏酸峰面积的RSD为0.9%，结果表明精密度良好，符合分析要求。
3.6. 重复性试验
取同一批号的供试品，按“3.2.1.”项下制备样品溶液，平行制备6份，按“2.1.”项色谱条件测定，以峰面积计算含量，羟基红花黄色素A峰面积的RSD为1.8%，阿魏酸峰面积的RSD为1.2%，结果表明本方法重复性符合要求。
3.7. 稳定性试验
取“3.6.”项下其中一份供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件下，分别在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h测定1次。测定供试品中羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量，以观察供试品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。试验结果表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，能够满足测定需要。
3.8. 加样回收试验
取已知含量的供试品(批号：20200201)适量，加入适量混合对照品溶液，制成低、中、高三个不同浓度的供试品溶液各3份，分别测定其含量，计算羟基红花黄色素A平均回收率为95.9%，RSD为0.8% (n = 6)；阿魏酸平均回收率为98.9%，RSD为1.0% (n = 6)。试验结果表明，该方法准确度符合规定。结果见表3~4。
Table 3. Results of the recovery test for hydroxysafflower yellow pigment A (n = 6)
表3. 羟基红花黄色素A加样回收试验结果(n = 6)
Table 4. Results of Ferulic Acid sample recovery test (n = 6)
表4. 阿魏酸加样回收试验结果(n = 6)
3.9. 样品测定
对3批样品进行测定，分别按“3.2.1.”项下方法制备供试品溶液，按3.1.”项下色谱条件测定，以峰面积计算含量，结果见表5。
Table 5. Determination results of three batches of samples
表5. 三批样品测定结果
4. 讨论
4.1. 色谱条件的选择
主要依据供试品溶液中羟基红花黄色素A和阿魏酸主峰有无干扰，通过DAD检测器对供试品中羟基红花黄色素A和阿魏酸的全波长检测，经比较供试品溶液在以乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相，波长为340 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃的色谱条件下，羟基红花黄色素A和阿魏酸主峰与其他杂质峰分离良好，羟基红花黄色素A主峰的纯度因子999.92，阿魏酸主峰的纯度因子1000，在可接受的阈值内。
4.2. 供试品溶液制备方法选择
比较了提取溶剂水、甲醇、50%甲醇，提取方法加热回流30 min、超声25 min等不同的方法，结果表面用50%甲醇，超声提取操作简单，测定的羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量较高且与其他提取方法基本一致。
4.3. 综合评价
本文参考国内外大量中成药中有关羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量测定方法的文献资料和多次试验，建立了本实验方法，实验结果显示，本方法简便、准确，结果稳定，可用于控制跌打活血散的质量及本品中羟基红花黄色素A和阿魏酸含量的质量评价。