摘要:为了测定动物源性食品中地西泮残留，采用分散固相萃取前处理方法，采用液相色谱串联质谱法为的方法测定地西泮，测定结果符合国家要求。线性方程为Y = 110356x，r
2为0.9993，在0.05~2.00 ug/L范围内线性良好，方法加标回收率为97.0%~97.5%，相对标准偏差为0.33%~1.43%，该方法操作快速、简单、灵敏度高、试剂用量少、对环境友好、回收率达到满意效果。
Abstract:In order to determine the residue of diazepam in animal derived foods, a dispersion solid-phase extraction pretreatment method was used, and the method of liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to determine diazepam. The determination results met the national requirements. The linear equation is Y = 110356x, r
2is 0.9993, and the linearity is good in the range of 0.05~2.00 ug/L. The recovery rate of the method with added standard is 97.0%~97.5%, and the relative standard deviation is 0.33%~1.43%. This method is fast, simple, sensitive, has low reagent dosage, is environmentally friendly, and achieves satisfactory recovery rate.
1. 引言
地西泮，又名安定，具有催眠作用的药物。在临床医学中是比较常用的镇静催眠和抗焦虑药物，患者长期服用会产生强烈的耐药性和依赖性 [1] [2] 。然而，一些养殖户将此药用于畜禽饲料中，使动物少动嗜睡，从而快速增肥，缩短养殖时间。该类药物经过食物链传递给人继而对人体产生很大的危害，因此对动物源性食品中地西泮药物残留检测非常必要 [3] [4] 。
地西泮药物已在畜禽产品、水产品中普遍有检出，而且检出频率极高，GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定在动物性食品中不得检出地西泮，农业176号公告规定严禁在饲料和动物饮用水中使用地西泮等精神类药物。目前地西泮的检测方法较多，主要有气相色谱–串联质谱法(GC-MS) [1] [5] [6] [7] 、高效液相色谱法(HPLC) [8] [9] 和高效液相色谱–串联质谱法(HPLC-MS/MS) [10] - [16] 、胶体金免疫层析法 [17] 等。张玉洁等利用采用气相色谱–微电子捕获相萃取小柱净化，甲醇–水(体积比70 + 30)洗脱，外标法定量，该方法均满足分析试验要求。何连军等通过型固相萃取柱为净化手段，采用液相色谱–串联质谱法测定水产品中地西泮残留量；该方法通过内标法定量，检出限为0.03 μg∙kg−1，添加回收范围为90.9%~98.3%，相对标准偏差为0.63%~6.68%。桑丽雅等采用胶体金免疫层析法快速检测水产品中地西泮残留量；该方法利用免疫磁珠选择性吸附、分离水产品中地西泮残留，操作简便，灵敏度高，特异性强，稳定性好。
超高效液相色谱–串联质谱法(UPLC-MS/MS) [10] - [16] 拥有超高效液相快速、有效的分离能力和串联质谱的精准灵敏度，是一种快速发展的分析技术。将超高效液相色谱–串联质谱法与分散固相萃取技术相结合，是目前比较流行的检测方式，兼具两者的优点，可以真正实现多种兽药残留的快速检测。该研究使用分散固相萃取技术进行前处理，超高效液相色谱–串联质谱法为检测方法，实现了地西泮残留的快速检测，为分散固相萃取前处理方式在水产品领域的应用提供更强的保障。当前未有各类产品地西泮残留量的限量标准，为了快速准确定量地西泮药物在动物源食品中的残留量，本文建立了分散固相萃取联合液相色谱串联质谱测动物源食品中地西泮的残留的方法，以期为动物源性食品中地西泮的检测提供数据基础。
2. 仪器与试剂
2.1. 仪器
超高液相色谱仪(LC-40NX)：日本岛津有限公司，三重四级杆质谱仪LCMS-8050；电子天平(FA2204B)：上海民侨精密科学仪器有限公司；高速冷冻离心机(H1650-W)：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；垂直振荡器(V12)睿科集团有限公司；漩涡混合器(IKA vortex 4数显型)：上海泰坦科技股份有限公司；冰箱(BCD-218)：博西华家用电器有限公司。
2.2. 试剂
甲醇、乙腈、甲酸，正己烷，光谱纯，购自默克；甲酸(质谱纯)购自默克；地西泮(含量 > 99.98%) 100 μg/mL。酸性氧化铝(200目)、氯化钠均为分析纯。
2.3. 样品
鱼、虾、鸡、猪肉、猪肝、鸡蛋购买于市场。
3. 实验
3.1. 样品预处理
取样品可食用部分，缩分，切碎，混匀，放入捣碎机中捣碎，装入洁净容器中密封，于冰箱中−18℃以下保存，待用。
3.2. 提取净化
称取2.00 g试样于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，加入5粒锆珠，与1500 r/min涡旋2 min，然后再加入2 g氯化钠，2 g酸性氧化铝，于2000 r/min涡旋1 min，450 r/min垂直震荡5分钟后，再继续10000 r/min离心5分钟，取上清液加入5 mL正己烷涡旋1 min，10000 r/min离心5 min，采用氮气吹扫的方法去掉正己烷，过0.22 um滤膜，得到待测液。
3.3. 分析条件
3.3.1. 液相条件
色谱柱：Shim-pack GIST C18，2.1 mm I.DX100 mmL，2 μm；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；流动相：A相0.1%甲酸水溶液、B相0.1%甲酸甲醇溶液
洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱程序见表1。
Table 1. Gradient elution procedure
表1. 梯度洗脱程序
3.3.2. 质谱条件
离子化模式：ESI (+)；离子源接口电压：0.5 KV；加热气：空气10.0 L/min；雾化气：氮气2.0 L/min；干燥气：氮气 10 L/min；碰撞气：氩气；
源温度：350℃；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描方式：多反应监测(MRM)。
驻留时间：100 ms；延迟时间：3 ms。地西泮的质谱检测参数见表2。
Table 2. Mass spectrometry detection parameters of diazepam
表2. 地西泮的质谱检测参数
*：为定量离子。
3.4. 标准工作液配制
地西泮标准中间液(1.0 mg/L)：用空白基质依次稀释成0.05 μg/L、0.10 μg/L、0.50 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L不同浓度的标准工作液。
4. 结果与讨论
4.1. 标准曲线
在选定的色谱条件和质谱参数下测定分析，以目标物定量离子峰面积和相应定量离子峰面积之比(y) 为纵坐标，以目标物浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线(如图1)，结果Y= 110356x，r2为0.9993，在0.05~2.00 ug/L范围内线性良好。
4.2. 添加回收试验结果
开展加标回收实验，分别向实验样品中添加低、中、高(0.0500、0.1000、2.00 mg/kg) 3个水平的地西泮标准溶液，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。
Table 3. Results of spiked recovery rate (n = 5)
表3. 加标回收率结果(n = 5)
方法加标回收率为97.0%~97.5%，相对标准偏差为0.33%~1.43%，说明方法的准确度与精密度较好，能满足国家标准GB/T 27404-2008《中华人民共和国国家标准实验室质量控制规范食品理化检测》中实验室质量控制规范。
5. 结论
本文建立了液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中地西泮残留的方法，结果Y= 110356x，r2为0.9993，在0.05~2.00 ug/L范围内线性良好，方法加标回收率为97.0%~97.5%，相对标准偏差为0.33%~1.43%，该方法操作快速、简单、灵敏度高、试剂用量少、对环境友好、回收率达到满意效果。方法学验证结果表明，该方法的检出限及定量限、回收率、精密度等指标均符合要求，适合于动物源性食品中地西泮残留量的定量分析，能够为动物源性食品中地西泮残留量监管和风险评价提供有效技术支撑。