1. 引言

纳米氧化铈(Nano cerium dioxide, nCeO₂)是世界上产量最大的金属氧化物纳米颗粒之一，至2050年全球年产量可达1万吨 [1] 。它可作为抛光剂、光催化材料、燃料电池电解质和药物载体，广泛应用于工业、能源、医药等领域 [2] [3] 。nCeO₂在生产和使用过程中，通过工业废水、垃圾渗漏等途径进入水环境中，污染了江、河、湖、海等自然水体。nCeO₂颗粒通过水生生物的摄食或附着在水生生物的体表，逐渐渗透在水生生物体内，干扰水生生物的摄食、能量代谢等生理过程，对水生生物健康和水域生态系统平衡带来了潜在的危害 [4] [5] [6] 。5 mg/L的nCeO₂可抑制月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的生长 [7] 。暴露于400 mg/L nCeO₂就会导致斑马鱼(Daniorerio)胚胎畸形，畸形部位主要发生在尾部，畸形率和死亡率随药物浓度的增加而增加 [8] 。彗星试验显示nCeO₂能诱导大型溞和摇蚊幼虫(Chironomusriparius) DNA损伤，具有遗传毒性 [9] 。近年来关于nCeO₂等纳米金属颗粒对水生生物的急、慢性毒性、生殖毒性效应等的报道已有不少。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一种在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在，在进化过程中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 [10] 。MAPK基因家族成员有MAPK激酶激酶激酶(MAP kinase kinase kinase kinase, MKKKK, MAP4K)、MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase, MKKK, MAP3K)、MAPK激酶(MAP kinase kinase, MKK, MAP2K)和MAPK (MAP kinase)。在环境胁迫下，这些MAPK酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、繁殖等多种生理过程，来应对环境胁迫 [11] [12] 。海鞘(Phallusiamammillata)胚胎在三丁锡暴露下，随着药物浓度的增高(0.5~10 mM)，海鞘胚胎中的MAPK磷酸化水平显著降低，导致海鞘胚胎发育异常 [13] 。鲤鱼(Cyprinus carpio)在氯吡硫磷暴露下随着药物浓度的增高(1.16~111.6 μg/L)，MAPKp38和ERK高表达，激活MAPK/NF-κB/TNF-α通路，诱发了炎症反应 [14] 。将紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)血细胞短时间暴露在微量抗菌剂三氯生中，导致血细胞溶酶体膜被破坏，水解酶释放，最终细胞崩解、死亡，三氯生对血细胞的毒性效应与MAPK基因的调控作用相关 [15] 。在副溶血性弧菌感染的深海贻贝(Bathymodiolusazoricus)血细胞中发现MAPKp38基因高表达，参与了贻贝对抗细菌的免疫机制 [16] 。副溶血性弧菌感染的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)血细胞中EsMAPKK基因的mRNA水平出现明显的高表达，提示MAPKK基因家族参与了中华绒螯蟹的抗菌免疫应答过程 [17] 。斑马鱼暴露于4 mg/L噻苯唑和0.5 mg/L代森锰锌下，均会诱导斑马鱼ERK、MAPKp38和Akt基因的磷酸化，影响斑马鱼PI3K/Akt和MAPK信号通路，导致斑马鱼体长发育不良，细胞内活性氧水平升高，大量细胞凋亡，造成严重的DNA损伤 [18] [19] [20] [21] 。

大型溞(Daphnia magna)是在淡水水域中常见的小型浮游动物，在全世界广泛分布，是淡水生态系统食物网中的关键环节 [22] 。由于其生长速度快、繁殖力强、饲养方便、易于操作，常被用作水生态环境监测的模式生物 [23] [24] [25] 。大型溞暴露于纳米氧化锌、纳米氧化钛、纳米氧化硅48 h后，和对照组相比，其蜕皮、能量代谢和DNA合成等相关基因的转录表达明显下调 [26] 。0.8 μg/L纳米银暴露24 h破坏大型溞的蛋白质代谢和信号转导途径 [27] 。0.06 mg/L纳米氧化锌48 h导致了大型溞几丁质酶基因表达下调，细胞Ca²⁺稳态破坏，消化酶的表达降低 [28] 。然而，对于nCeO₂暴露下大型溞MAPK基因家族成员的生物学作用还未见报道。因此，本文利用BLAST比对、HMM模型等生物信息学方法分析大型溞MAPK基因家族成员的种类、理化性质和家族分类、进化与结构特点，通过实时荧光定量PCR扩增(q-PCR)技术分析nCeO₂暴露下大型溞MAPK基因的表达模式，以期鉴定基因家族成员中参与nCeO₂暴露下大型溞机体应激反应的关键基因，为进一步阐明nCeO₂暴露对大型溞的毒性效应提供科学参考。

2. 材料与方法

2.1. 大型溞MAPK基因序列分析

从NCBI下载大型溞基因组数据(ASM2063170v1.1)，进行Blast-search，获得可能的候选MAPK氨基酸序列，从Pfam (http://pfam.xfam.org/)中下载了MAPK结构域的HMM模型(PF00069、PF07714)，利用此HMM模型对候选的MAPK进行识别，并通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域分析，剔除不含有MAPK家族蛋白结构域的序列。通过ExPASy数据库(https://www.expasy.org/protparam)中的ProtParam工具对DmMAPK基因家族进行理化性质的分析。MEME5.5.4 (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)用于分析MAPK蛋白质家族成员的保守基序，最大图案数设定为 10，其它参数为默认值，结合进化树，用TBtools进行基序结构的可视化。用MEGA7软件 [29] ，选择Alignment by ClustalW进行序列比对，使用邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发生树，最后用Chiplot网站(https://www.chiplot.online)对建成的树进行修饰。

2.2. 实验动物和药物处理

大型溞来自大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室。从克隆培养的大型溞中选取所生的第三窝健康新生溞，挑出用脱氯水在1 L烧杯中培养。

大型溞分为三组，一组为对照组，另两组为药物处理组。药物处理组大型溞分别暴露于50、150 mg/L的浓度nCeO₂。每组设置3个重复，每个重复烧杯中放入100只大型溞。为了避免大型溞摄食影响实验结果，实验期间不投喂。24和48 h后将存活的大型溞分别放入1.5 ml离心管中，吸干水分，保存到碎冰中，用于提取样品总RNA。

2.3. RNA的提取及反转录

每个重复取45只活的大型溞立即在冰上用研钵在Trizol溶液(生工生物工程，上海)中匀浆，经过消化、离心、洗脱等操作之后，提取来自大型溞的总RNA，在1.2%琼脂糖凝胶上分析RNA的完整性。使用艾科瑞生物公司的Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR对大型溞的总RNA进行反转录。

2.4. 实时荧光定量PCR测定

用NCBI-Primer设计大型溞MAPK基因家族成员序列的特异性引物，用于qPCR的引物序列如表1所示。引物由生工生物工程(上海)合成。在Applied Biosystems™ 7500仪器进行qPCR，反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s 60℃ 30 s，40个循环。以Beta-actin作为内参基因。大型溞Beta-actin引物从文献中引用 [30] ，应用2^–ΔΔct法计算MAPK基因的相对表达量。

2.5. 数据分析

使用Excel (T-test检验)分析对照组和nCeO₂处理组大型溞MAPK基因家族的表达差异，所有实验采用3个生物重复，P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为差异极其显著。

3. 结果

3.1. 大型溞MAPK基因家族理化性质分析

笔者通过BLAST比对进行大型溞的全基因组筛选，结合HMM模型和SMART分析等生信工具鉴定出大型溞的14个MAPK基因家族成员。对这14个基因的命名，我们采用了“物种名首字母缩写 + 基因名 + 数字”的方式，即大型溞拉丁语物种名Daphnia magna两个单词的首字母“Dm”，接着是MAPK基因成员的名字，其后是NCBI数据库中代表不同MAPK基因家族亚型成员的数字，例如DmMAPK1、DmMAP2K1。大型溞14个MAPK基因家族成员蛋白质的理化性质特征见表2。这14个基因分别位于大型溞的1~7和10号等8条染色体上，其中第7号染色体上分布的MAPK基因家族成员最多，有DmMAP2K3、DmMAP2K4和DmMAP2K7等3个基因。MAPK基因家族成员蛋白质序列长度范围为361~1546 aa。其中DmMAPK-p38b被鉴定为最小的MAPK蛋白，只有361个氨基酸，而最大的MAPK蛋白是DmMAP3K4，有1546个氨基酸。大型溞MAPK基因家族成员蛋白质分子量变化较大，范围为38.93~177.02 kDa，其等电点的范围为5.3~9.51，蛋白质分子的不稳定系数范围为34.50~74.07，DmMAPK2、DmMAPK4、DmMAP2K1等11个为不稳定蛋白，DmMAPK-p38b、DmMAPK1、DmMAP2K3为稳定蛋白。

3.2. 大型溞MAPK基因家族成员结构与进化分析

笔者使用SMART程序分析每个MAPK蛋白的结构域(图1)，发现大型溞MAPK基因家族成员DmMAPK1、DmMAPK2等12个成员都具有S_TKc结构域，DmMAPK4有STYKc和CASC结构域，DmMAP3K11有SH3和TyrKc结构域。笔者利用MEME比较大型溞14个MAPK基因家族成员蛋白质序列中存在的保守基序，从所有MAPK基因家族成员中总共鉴定出十个不同的基序，命名为motif 1~motif 10 (图2)。发现14个MAPK基因家族成员，含有基序最多的有10个，最少的含有4个基序。motif 1 (HRDLKPSNILLNERGEVKJCD)、3 (YAGTRAYMAPEVI)、6 (DLVEKCLEKBPKKRPTAEQLLEHPFL)和7 (IGEIARQILRGLKYLHSNGII)是大型溞14个MPAK蛋白共有的保守基序，motif 1、3、6和7是MAPK家族特征S_TKc结构域。14个MAPK基因家族成员中有13个成员含有motif 2 (DVWSLGITLVELATGKPPYPDL)和5 (GSGAYGVVYKARHNKTGTIMAVKKI)，而这两个基序在DmMAPK4蛋白中不存在。motif 9 (EQKRLLMDLDVVMRSNDCPY)只存在于MAP2K3、MAP2K4、MAP2K7这三个蛋白中。MAPKp38b、MAPK1、MAPK2、MAPK4蛋白中不含有motif 4 (IVAFYGALLQEGDLWICMEYM)。

我们利用MEGA 7软件，使用CLUSTAL W和邻接法，构建了来自人类(Homo sapiens)、小鼠(Musmusculus)、斑马鱼(Daniorerio)、果蝇(Drosophila melanogaster)、中华对虾(Penaeuschinensis)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、蚤状溞(Daphnia pulex)和大型溞的MAPK基因家族成员的系统发育树。如图3所示，大型溞MAPK基因家族分为MAP4K、MAP3K、MAP2K和MAPK这4个亚家族。其中MAPK亚族共有4个成员，MAP2K亚族有4个成员，MAP3K亚族共有5个成员，MAP4K亚族有1个成员。由系统发生树看出，MAPK蛋白分成三个大的分支。第一个分支由7个物种的MAPK亚族(除DmelMAPK4)和大部分的MAP3K亚族的组成，第二个分支由6个物种中MAP2K亚族、MAP4K亚族、部分的MAP3K亚族(DmMAP3K4、HmMAP3K1、MmMAP3K1)和一个DmelMAPK4构成，第三个分支由大型溞的DmMAP3K-13-A、DmMAP3K7和秀丽隐杆线虫的CeMAP3K-sdlk-1、CeMAP3K-mom-4组成。

3.3. nCeO₂暴露对大型溞MAPK基因家族成员的表达的影响

为了研究nCeO₂暴露下大型溞MAPK基因家族成员的表达模式，我们分析了不同浓度、不同时间nCeO₂暴露对14个DmMAPK基因转录水平的影响(图4)。nCeO₂暴露24 h，与对照组相比，大型溞药物处理组各个MAPK基因的表达显著下降(P< 0.01)。随着暴露时间的延长，48 h后 50和150 mg/LnCeO₂

暴露组大型溞DmMAPK-p38b、DmMAPK4、DmMAP2K4、DmMAP3K4、DmMAP3K7、DmMAP3K11、DmMAP4K5等7个基因的表达明显上调(P< 0.01)，DmMAPK2、DmMAP2K3、DmMAP3K13-A的表达显著下降(P< 0.001)，DmMAP2K7的表达差异不显著。

4. 讨论

水生动物在生长发育过程中不可避免地受到外界环境胁迫的影响。由于nCeO₂在水环境的持续输入和具有生物富集性，nCeO₂的水生态毒理效应已成为国内外关注的热点。暴露在较高浓度nCeO₂(1000 mg/L)下，14种纤毛原生生物的死亡率随浓度和时间的增加而增加 [31] [32] 。在nCeO₂暴露下，斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)的光合作用和能量代谢受到抑制 [32] 。在nCeO₂暴露下，淡水涡虫(Dugesiajaponic)的再生过程被抑制，细胞稳态和抗氧化防御系统被破坏，DNA损伤升高 [33] 。大型溞对水环境中的污染物敏感性高，常用来评估淡水生态系统中存在的污染物的毒性效应，但是在nCeO₂暴露下大型溞MAPK基因的作用机制还不清楚。

MAPK基因家族是真核生物中广泛存在且高度保守的信号转导途径，各个MAPK基因家族成员广泛参与细胞内代谢、免疫反应，以及生物体对多种生物与非生物胁迫应答过程 [34] [35] 。PmMAPKK基因在斑节对虾(Penaeusmonodon)的卵巢中表达量最高，这表明PmMAPKK基因在生殖细胞的发育和成熟中起着非常重要的作用，PmMAPKK在肝胰腺和鱼鳃中的高表达，表明它同时具有免疫和抗应激功能，将PmMAPKK基因敲除后，斑节对虾在低盐环境下的死亡率增加，说明PmMAPKK基因参与了斑节对虾对非生物胁迫应答的过程 [36] [37] 。在高温、缺氧条件下，青蛤(Cyclinasinensis)的MmMAPKK基因的表达与对照组相比显著上调，证实了MmMAPKK基因参与了生物对非生物胁迫应答的过程 [38] 。为了探讨MAPK在nCeO₂暴露下对大型溞的毒性效应中可能具有的生物学作用，笔者通过生物信息学手段鉴定大型溞的MAPK基因家族成员，并检测了nCeO₂暴露对各个基因成员转录表达的影响。我们使用BLAST比对、HMM模型结合SMART等方法鉴定出了14个大型溞MAPK基因家族成员。这与在其他节肢动物斑节对虾、果蝇中发现的MAPK基因家族成员基本一致，但在数量上比哺乳动物少 [11] [39] [40] 。通过对大型溞14个MAPK基因的理化性质和结构域进行分析(表2，图1)发现这14个基因分布位于大型溞的1~7和10号等8条染色体上，MAPK家族蛋白质序列的长度范围为361~1546 aa，分子量大小在38.93~177.02 kDa之间，其等电点的范围为5.3~9.51，蛋白质分子的不稳定系数范围为34.50~74.07。DmMAPK2、DmMAPK4、DmMAP2K1等11个为不稳定蛋白，与MAPK蛋白作为细胞信号级联反应的激酶作用一致。大型溞MAPK基因家族成员DmMAPK1、DmMAPK2等12个成员都具有S_TKc结构域，即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在多种细胞过程中发挥作用，包括分裂、增殖、凋亡和分化。磷酸化通常通过改变酶活性、细胞位置或与其他蛋白质的结合导致靶蛋白的功能改变 [41] [42] 。motif1、3、6和7是大型溞14个MPAK蛋白共有的保守基序(图2)。通过分析基序在MAPK基因序列中的位置，我们发现这4个基序位于S_TKc结构域中，推测这些位点和激酶的生物学功能密切相关，因此在进化上具有保守性。我们构建了大型溞、蚤状溞等7个物种的MAPK基因家族成员的系统发育树(图3)，系统发生分析显示，大型溞的14个MAPK基因分别属于4个亚家族，而且发现脊椎动物到无脊椎动物，MAPK基因在进化过程中是较为保守的。

为了检测MAPK是否参与大型溞对nCeO₂胁迫的分子响应，我们将大型溞暴露于50 mg/L和150 mg/L的nCeO₂溶液24、48 h后，利用qPCR技术分析nCeO₂暴露下大型溞MAPK基因mRNA的表达模式(图4)，发现48 h后大多数MAPK基因受到nCeO₂的诱导，表达水平较对照组显著上调，其中DmMAPK-p38b、DmMAPK4、DmMAP2K4、DmMAP3K4、DmMAP3K7、DmMAP3K11和DmMAP4K5的表达尤为显著。预示这些基因与大型溞对环境胁迫的应答相关。DmMAP2K7的表达差异不显著，在这个过程不起主要作用。DmMAPK2、DmMAP2K3和DmMAP3K13-A基因在在整个实验过程中的表达水平较对照组显著下调。对紫贻贝进行各种重金属诱导，发现MAPKp38信号传导通路能引发组织特异的促凋亡和抗凋亡活动 [43] 。温度高于24℃后，紫贻贝后闭壳肌和套膜中磷酸化的MAPKp38和MAPK-JNK分子显著增加，MAPKp38和MAPK-JNK信号途径诱导了热激蛋白的表达 [44] 。随着多氯联苯同源物P153暴露时间的增加，紫贻贝体内MAPKp38和MAPK-JNK磷酸化水平增高，激活ERK，表明MAPK信号途径参与了软体动物的免疫反应 [45] [46] 。经虹膜病毒处理石斑鱼(Epinepheluscoioides)，MAPK-JNK信号通路相关基因的表达上调，说明MAPK-JNK信号通路在石斑鱼由病毒引起免疫反应中具有重要的调控作用 [47] 。重金属铅暴露下，鲤鱼通过激活MAPK调控通路，诱导细胞内活性氧升高，并抑制超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，最终引发鲤鱼头肾炎症反应 [48] 。岸溪摇蚊(Chironomusriparius)暴露于重金属镉，通过CrMAPKp38基因表达的上调，激发了MAPKp38信号转导途径，介导机体氧化应激反应，显示了CrMAPKp38基因在重金属胁迫应答中的作用 [49] 。长期暴露于三氯生可显著上调斑马鱼肝脏中MAPK和p53基因的表达，激活MAPK/p53凋亡信号通路 [50] 。暴露聚苯乙烯纳米颗粒下，斑马鱼发育过程中激活MAPKp38信号通路，导致氧化损伤和细胞凋亡 [51] 。大型溞MAPK基因家族成员在进化过程上高度保守，由此我们推测大型溞MAPK可通过参与细胞内的一些生命过程的调控，如氧化还原和细胞凋亡等过程，与大型溞对纳米金属的胁迫应答相关。

5. 结论

综上，我们从大型溞全基因组鉴定出14个MAPK基因家族成员，分别属于MAP4K、MAP3K、MAP2K和MAPK这4个亚家族，分布于大型溞的1~7和10号等8条染色体上。DmMAPK1、DmMAPK2等12个成员都具有S_TKc结构域，即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶在多种细胞过程中发挥作用，包括分裂、增殖、凋亡和分化。所有的DmMAPK基因家族成员都具有motif 1、3、6和7这4个保守基序。nCeO₂暴露引起大型溞MAPK基因家族的DmMAPK-p38b、DmMAPK4、DmMAP2K4、DmMAP3K4、DmMAP3K7、DmMAP3K11、DmMAP4K5等7个基因的表达显著上调，激活MAPK信号通路，可能使MAPK介导的大型溞生命活动出现异常。这些结果为进一步探究大型溞MAPK基因在应对环境胁迫的功能奠定了基础。

基金项目

本论文由国家自然科学基金(42077226)和辽宁省教育厅项目(LJKMZ20221102)资助。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献