bp Bioprocess 2164-5566 2164-5582 beplay体育官网网页版等您来挑战！ 10.12677/bp.2024.143017 bp-95937 Articles 生命科学 高产PSA的基因工程菌株构建
Construction of Genetically Engineered Strains for High-Yield Polysialic Acid (PSA) Production
常化难 1 甄庚尧 1 王崇川 1 李 宁 2 周焕霞 2 曹建帮 2 高学秀 2 徐艳秋 1 李 昊 1 朱德强 1 刘新利 1 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学部，山东 济南 山东星光首创生物科技有限公司，山东 德州 29 08 2024 14 03 132 141 1 7 ：2024 29 7 ：2024 29 8 ：2024 Copyright © 2024 beplay安卓登录 All rights reserved. 2024 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 聚唾液酸(PSA)是一种具有重要生物功能的高分子多糖，广泛存在于自然界和人体中。由于其低免疫原性和良好的生物降解性，PSA被认为是一种理想的药物控释材料。本研究以大肠杆菌K87为出发菌株，通过过表达Neu5AC合成路径中的关键基因neuD，构建了高效合成PSA的基因工程菌株。通过摇瓶发酵和发酵罐发酵实验，验证了不同拷贝数neuD基因对PSA产量的影响。结果表明，高拷贝数表达载体能显著提高PSA的产量，其中E. coli K87-6菌株在5 L发酵罐中PSA产量达8.4 g/L，比出发菌株提高27%。本研究构建的高效合成PSA的基因工程菌株在工业生产中具有广泛的应用前景。
Polysialic acid (PSA) is a high-molecular-weight polysaccharide with significant biological functions, widely found in nature and the human body. Due to its low immunogenicity and good biodegradability, PSA is considered an ideal material for drug delivery systems. In this study, Escherichia coli K87 was used as the starting strain to construct genetically engineered strains for efficient PSA production by overexpressing the key gene neuD in the Neu5AC synthesis pathway. The effects of different copy numbers of the neuD gene on PSA yield were verified through shake flask and fermenter experiments. The results showed that high-copy-number expression vectors significantly increased PSA yield, with the E. coli K87-6 strain achieving a PSA yield of 8.4 g/L in a 5 L fermenter, which is 27% higher than the starting strain. The genetically engineered strains constructed in this study have broad application prospects in industrial production.
聚唾液酸，基因工程大肠杆菌，neuD，发酵
PSA
Genetically Engineered Escherichia coli neuD Fermentation 1. 引言

聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)是由唾液酸单体N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)以α-2,8或α-2,9糖苷键连接而成的 [1] ，含有11个碳原子，是呈现线性聚合的阴离子多糖，聚合度(DP)大多为8~400 [2] 。在自然界和人体中广泛存在，作为糖蛋白的成分存在哺乳动物体内，在细胞间信息传递、识别、细胞附着和细胞分化等生理过程中起重要作用 [3] 。在细菌中作为胞外多糖成分，具有保护作用 [4] 。PSA具有免疫原性较低，生物降解性好的优点，其生物降解生成的唾液酸单体Neu5Ac对人类健康起重要作用，能有效地促进胚胎发育和婴儿神经发育 [5] 。PSA广泛存在于大肠杆菌中，也是最早在大肠杆菌中被发现，是细菌表面荚膜的重要组成成分，起到有效的保护作用。聚唾液酸是白色无固定形态的粉末状高聚合物，极易在水中溶解且溶解度比较高，粘度低 [6] 。PSA的熔点可以达到180℃以上，难溶于有机溶剂，在甲醇中微溶，在乙醚和乙醇中不溶解。遇酸会被降解，酸性条件下稳定性降低，不易储存 [7] 。其稳定性较差，会生物降解生成单体唾液酸(Neu5Ac)，唾液酸单体也极易溶于水，水溶液呈现无色，非常稳定。Neu5Ac可以在4℃环境中长时间保存不易变质 [8] 。正是因为PSA具有较低的免疫原性和较好的生物降解性，所以被认为是一种理想的基础药控材料 [9] 。PSA能有效地促进大脑中神经细胞发育，可以调节大脑中枢神经系统 [10] [11] 。早在高等脊椎动物胚胎时期，PSA就发挥着至关重要的作用，随着胚胎的发育 [12] ，PSA为神经细胞的生长、分化和连接提供动力。在婴儿时期，大脑中的PSA含量会比其他年龄段的含量更高 [5] ，这是因为PSA是黏附分子(NCAM) [13] [14] 的主要成分，而随着年龄增长，神经细胞上的黏附分子含量就会降低。PSA具有提高大脑记忆力的功能，在促进高等脊椎动物大脑和神经系统发育上起着积极的作用。PSA和Neu5Ac的稳定高效制备正受到众多科学家的广泛关注 [15] 。

大肠杆菌胞内PSA合成代谢途径已被深入研究，如 图1 所示 [16] 。底物葡萄糖经过系列酶促反应合成Neu5Ac [17] ，其作为PSA的重要原材料，增加Neu5Ac产物积累促进聚合反应进行变得尤为重要。ManNAc经Neu5Ac醛缩酶 [18] (NanA基因编码)和Neu5Ac合成酶 [19] [20] (NeuB基因编码)催化合成Neu5Ac，而NanA的催化反应是一个双向可逆解的反应，NanA同样会催化Neu5Ac进行可逆反应使其裂解为丙酮酸和ManNAc [21] [22] 。KPS基因簇 [20] [23] 中第二个区域包含6个基因如neuA、neuS和neuD等推动了PSA合成。游离的唾液酸单体Neu5Ac被酶(NeuA基因编码)催化生成唾液酸胞苷单磷酸脂(CMP-Neu5Ac)，NeuA基因编码的酶 [24] 作为一种双功能酶还可以催化大多数乙酰化的唾液酸胞苷单磷酸脂(CMP-AcNeu5Ac)转化为唾液酸胞苷单磷酸脂(CMP-Neu5Ac)。NeuA基因通过编码CMP-Neu5Ac synthase表达，为进一步聚合为PSA提供供体。NeuD基因编码的转移酶 [25] 使Neu5Ac的残基乙酰化，催化Neu5Ac生成残基乙酰化唾液酸单体。PSA是由Neu5Ac通过α-2,8或α-2,9糖苷键连接构成，NeuS基因就是编码α-2,8唾液酸转移酶 [16] ，把CMP-Neu5Ac形式的唾液酸单体转移到聚唾液酸分子的非还原端，聚合为PSA。在KPS基因簇的其他保守区域中，主要参与PSA和底物的运输过程，各个区域相互作用共同推进PSA在胞内代谢反应 [26] 。

Figure. 1. The pathway of PSA synthesis from glucose in Escherichia coli--图1. 大肠杆菌中葡萄糖合成PSA的路径--

在目前工业化生产PSA的工程菌基本上都是以单糖为底物，经过复杂的酶代谢过程才合成PSA。Glucose进入胞内后，经过6步酶催化反应生成Neu5Ac，此路径存在多条可逆降解反应从而增加了代谢流的阻力。基因控制合成的酶在催化Neu5Ac聚合为PSA的路径中起重要作用。考虑到增强聚合途径基因转录水平和酶表达水平从而可以强化聚合路径进一步提高PSA产量 [24] [26] ，提高Neu5Ac消耗效率促进其合成反应加快正向进行。

本研究针对上述问题，以E. coli K87为出发菌株过表达Neu5AC合成关键路径基因neuD，构建高效合成PSA基因工程菌。

 2. 材料与方法 2.1. 实验材料与试剂

本研究使用的菌株和质粒见 表1 。

<xref></xref>Table 1. Plasmids and strainsTable 1. Plasmids and strains 表1. 质粒与菌株

名称

 来源

 特征
质粒

 pACYCDuet

 实验室保藏

 低拷贝数表达载体
pETDuet

 实验室保藏

 中拷贝数表达载体
pRSFDuet

 实验室保藏

 高拷贝数表达载体
pTrc99A

 淼灵生物购买

 Trc启动子表达载体
pTrc99A-UD

 实验构建

 含neuD基因的pTrc99A重组质粒
pACYCPtrc-UD

 实验构建

 含Trc-neuD基因的pACYCDuet重组质粒
pETPtrc-UD

 实验构建

 含Trc-neuD基因的pETDuet重组质粒
pRSFPtrc-UD

 实验构建

 含Trc-neuD基因的pRSFDuet重组质粒
菌株

 E. coli DH5α

 实验室保藏

 重组质粒克隆宿主菌
E. coli K87

 实验室保藏

 出发菌株
E. coli K87-4

 实验构建

 含pACYCPtrc-UD质粒的重组菌株
E. coli K87-5

 实验构建

 含pETPtrc-UD质粒的重组菌株
E. coli K87-6

 实验构建

 含pRSFPtrc-UD质粒的重组菌株

LB培养基：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH 7.0，固体培养基加入2%琼脂粉。灭菌条件：121℃，20 min。

PSA发酵培养基：山梨醇40 g/L，磷酸氢二钾26.2 g/L，胰蛋白胨1.5 g/L，硫酸铵5 g/L，无水硫酸镁0.9 g/L (单独灭菌)，pH 7.0。灭菌条件：121℃，20 min。

各重组工程菌在接种前加入相应种类的抗生素，培养基中抗生素工作终浓度：Kan 50 mg/L、Amp 50 mg/L、Chl 25 mg/L。

利用Oligo 7设计引物，将设计好的引物送至生物工程(上海)股份有限公司进行合成，纯化方法为HAP (……碱基以内)或ultrapage (……碱基以上)，引物序列如 表2 所示。

<xref></xref>Table 2. The primer of PCRTable 2. The primer of PCR 表2. PCR引物
引物名称

 序列(5'-3')
pTrc99A-UD-F

 cagtcggtacctttttgcgccgacatcataa
pTrc99A-UD-R

 cgactgtcgacaccaataatactctttgagcct

如 表3 所示为本研究用到的药品试剂。常规试剂均为分析纯等级。

<xref></xref>Table 3. Laboratory reagentTable 3. Laboratory reagent 表3. 实验试剂
试剂名称

 生产厂家
BamHI内切酶、SalI内切酶、T4 DNA连接酶、10 × Single Buffer、绿如蓝核酸染料、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Chl)、DNA Marker、Loading buffer、DNA胶回收试剂盒

 生工生物工程(上海)股份有限公司
DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒

 北京诺贝莱生物科技有限公司

续表

2 × Taq Master Mix、2 × Phanta Max Master Mix

 南京诺唯赞生物科技有限公司
double distilled water (ddH2O)

 湖南艾科瑞生物工程有限公司
琼脂糖

 安徽白鲨生物科技有限公司
TAE溶液、硫酸卡那霉素(Kan)

 北京索莱宝科技有限公司
酵母浸粉、胰蛋白胨

 安琪酵母股份有限公司
浓盐酸

 烟台远东精细化工有限公司
2.2. 仪器与设备

高效液相色谱仪，LC-20AT，岛津公司；5 L发酵罐，Cla210-5L，安徽霍尔斯工程技术有限公司；生物传感分析仪；SBA-40E，山东省生物传感器重点实验室。

 2.3. 方法

本实验室之前已构建过重组表达载体pTrc99A-UD，以此为模板，用pTrc99A-UD-F/R为引物做PCR扩增实验。上下游引物分别加入BamHI和SalI两个酶切位点并优化，对PCR产物进行一系列双酶切、跑胶和纯化回收实验，获得目的基因片段Trc-neuD。Trc-neuD基因片段和Duet系列表达载体用相同的内切酶BamHI和SalI双酶切，纯化后使用T4 DNA连接酶进行连接，转入到E. coli DH5α感受态细胞中，提取质粒单酶切验证，选取验证成功的单菌落在LB液体培养基过夜培养，从菌液中提取重组质粒使用化学转化法转入到工程菌E. coli K87中，活化后从重组菌中提取质粒单酶切验证转化是否成功。将这三株重组菌株分别命名为E. coli K87-4、E. coli K87-5和E. coli K87-6。

(1) 摇瓶发酵

将适量经斜面培养基活化后的菌体细胞接种至含30 mLLB培养基的250 mL摇瓶中，35℃、220 r/min振荡培养10 h。以4%接种量接种至50 mL发酵培养基的300 mL摇瓶中，37℃、200 r/min振荡培养48 h。

(2) 发酵罐发酵

发酵在5 L玻璃搅拌罐生物反应器中进行，填充体积为3.5 L。接种前，将生物反应器温度、通气量灭菌。速率搅拌速度分别保持在37℃、0.5 vvm和200 rpm。当系统稳定后，将140 mL 10 h的种子培养物接种到生物反应器中。

发酵液检测：取1.5 mL发酵液加入到离心管中，在10,000 rpm的离心机中离心2 min后取上清，稀释10倍后进行检测。

PSA检测：使用高效液相色谱(岛津，LC-20AT)进行测定，采用SCR101H色谱柱(岛津)；流动相为5 mM硫酸；流速为0.6 mL/min；柱温为35℃；紫外检测波长196 nm；进样量10 μL，该检测条件下9.5 min左右出峰。

还原糖检测方法：利用生物传感分析仪实时检测发酵液中葡萄糖的剩余量 [27] 。

铵根离子检测方法：利用水杨酸钠–次氯酸钠法测定发酵液中的铵根离子 [28] 。

生物量检测方法：取适量发酵液稀释一定的倍数，利用紫外分光光度计在600 nm条件下的吸光度来代表发酵液中的生物量。以纯水为对照，发酵液的稀释倍数要使分光光度计读数控制在0.2~1.2之间比较准确。对于该发酵实验的大肠杆菌而言，1单位的OD600大约为0.45 g/L的菌体量。

 3. 结果与分析 3.1. 过表达关键基因neuD不同拷贝数载体构建

本实验室已经把neuD基因插入到了pTrc99A表达载体Trc启动子的下游，本研究把关键基因neuD分别插入到不同拷贝数Duet系列表达载体上( 图2(a) )，该基因目的片段包含Trc启动子和neuD基因两部分，研究neuD在不同拷贝数的表达载体中对PSA末端聚合路径的影响强度。pACYCDuet、pETDuet和pRSFDuet目的片段获取方法为提取质粒双酶切后跑胶纯化，琼脂糖凝胶电泳( 图2(b) )，pACYCDuet、pETDuet和pRSFDuet片段长度分别为3983 bp、5395 bp和3804 bp，与实验设计结果相同。目的基因和载体片段使用相同的快切酶双酶切，双酶切后使用T4 DNA连接酶将包含Trc启动子的neuD基因片段插入到Duet系列表达载体中。把pACYCPtrc-UD、pETPtrc-UD和pRSFPtrc-UD重组表达载体转入到宿主菌E. coli DH5α感受态细胞中活化培养。提取重组质粒单酶切验证，长度符合预期设计，提取质粒转入E. coli K87感受态细胞中培养。从三株重组工程菌菌液中提取质粒后单酶切跑胶，琼脂糖凝胶电泳实验如 图2(c) 所示，将这三株重组工程菌分别命名为E. coli K87-4、E. coli K87-5和E. coli K87-6。

Figure 2. (a) Construction of expression vectors with different copy numbers of the neuD series; (b) Amplification of target fragments pACYCDuet, pETDuet, pRSFDuet, and Trc-neuD; (c) Single enzyme digestion verification of extracted expression vectors from recombinant engineered bacteria; (d) PSA yield detection in recombinant bacteria from the Duet series--图2. (a) 不同拷贝数neuD系列表达载体构建；(b) 扩增目的片段pACYCDuet、pETDuet、pRSFDuet和Trc-neuD；(c) 重组工程菌提取表达载体单酶切验证；(d) Duet系列重组菌PSA产量检测-- 3.2. neuD不同拷贝数载体发酵PSA水平验证

不同拷贝数的Duet系列表达载体在工程菌中成功表达。将含有Trc启动子的neuD基因片段插入到不同拷贝数的Duet系列表达载体中对合成PSA具有较大差异。菌株E. coli K87-4发酵液中PSA产量明显低于其他两株，PSA产量在第28 h时达到0.67 g/L，与菌株E. coli K87相比下降59%。菌株E. coli K87-5发酵液中PSA产量在第32 h时达到最大值为1.77 g/L，相对于出发菌株E. coli K87产量提高9%，但略低于E. coli K87-2。菌株E. coli K87-6发酵液中PSA产量明显提升，在第32 h时PSA产量达1.95 g/L，比工程菌E. coli K87提高20%，比重组菌株E. coli K87-2提高7% ( 图2(d) )。

neuD作为聚合路径中最为关键基因，由实验结果可知不同拷贝数的neuD基因对PSA聚合路径影响结果不同。neuD基因由低拷贝表达载体pACYCDuet表达严重限制了残基乙酰化转移酶的活性，PSA聚合受到抑制。E. coli K87-4菌株的菌体生长量也明显低于其他菌株，可能是重组表达载体pACYCPtrc-UD的转入影响了菌体的生长，菌体量比较低也是导致E. coli K87-4菌株PSA合成量受到限制的一个重要原因。而高拷贝数的neuD基因有效地提高转移酶的表达水平并促进PSA的聚合，高拷贝数表达体的转入也不会对菌株自身代谢造成负担。neuD基因由中拷贝数表达载体pETDuet表达造成了PSA聚合的瓶颈期，这也是E. coli K87-5发酵液中PSA合成量略低于菌株E. coli K87-2的原因。

 3.3. 5 L发酵罐放大实验 Figure 3. (a) Experimental data of strain E. coli K87 in a 5 L fermenter; (b) Experimental data of strain E. coli K87-5 in a 5 L fermenter; (c) Experimental data of strain E. coli K87-6 in a 5 L fermenter--图3. (a) 菌株E. coli K87在5 L发酵罐中的实验数据；(b) 菌株E. coli K87-5在5 L发酵罐中的实验数据；(c) 菌株E. coli K87-6在5 L发酵罐中的实验数据--

对E. coli K87、E. coli K87-5和E. coli K87-6这3株菌株进行初步验证，酵罐通过转速、通气量和罐压共同调控发酵液中的氧气含量，相比摇瓶发酵其溶氧量更高，且补料和pH控制更加稳定，因此目标产物的合成量会大幅度上升。菌株E. coli K87-5在发酵过程中在第10 h时才开始生长，猜测对菌株改造后培养基中抗生素对菌株生长带来了负担。其他三株菌株表现正常，发酵至6.5 h左右罐内碳源消耗殆尽开始补加葡萄糖溶液，在生长指数期时对碳源消耗量比较大，生物量生长较快，此阶段约30 min手动补一次葡萄糖溶液至罐内浓度为20 g/L。菌株完成指数生长期后生物量较多，此阶段是大量合成PSA的关键时期，葡萄糖作为合成PSA的最初底物，因此要确保发酵罐内的碳源氮源充足。然而发酵至30 h左右时菌株开始出现裂解现象，生物量持续降低。

出发菌株E. coli K87在发酵第31.5 h时PSA产量达到6.59 g/L，比在摇瓶实验中产量提升4倍以上，指数生长期结束后菌体量最高达15.3 g/L，共消耗葡萄糖588 g，氨水382 mL ( 图3(a) )。该诱变菌株经过多次传代培养，在扩大培养后PSA聚合性能稳定未出现退化现象，所以对该菌从基因层面入手进行改造非常具有可靠性。

E. coli K87-5在第10 h才开始生长，前期生长速度缓慢。但培养至22 h时OD600 = 36.41仍然大于菌株E. coli K87的最高生物量，当发酵至32 h时PSA产量达7.43 g/L，比工程菌E. coli K87提高13%。E. coli K87-5在整个发酵过程中共消耗葡萄糖380 g，消耗氨水151 mL，其PSA达到最高点时PSA/OD = 0.31，当E. coli K87菌株PSA达到最高点时PSA/OD = 0.266，从碳氮源的消耗和PSA/OD分析可以看出重组菌E. coli K87-5比工程菌E. coli K87更占据优势( 图3(b) )。但重组菌E. coli K87-5前期菌体生长受到抑制是弊端，猜测导入重组质粒带来生长负担或是因为抗生素压力抑制菌体生长。

重组菌株E. coli K87-6发酵至26 h时PSA产量达8.4 g/L，生物量在第18 h时达到最大值。相比工程菌E. coli K87产量提高27%，且提前5 h达到产量最大值。当E. coli K87-6菌株PSA产量达到最大值时PSA/OD = 0.281而E. coli K87菌株PSA/OD = 0.266 ( 图3(c) )，可以看出对菌株末端聚合路径增强后提高单位细胞的产率。从营养物质消耗量来看共消耗葡萄糖680 g消耗氨水232 mL，PSA/消耗碳源和PSA/消耗氮源都比工程菌E. coli K87占据优势。

通过对比3株菌株5 L发酵罐扩大发酵实验，重组菌株E. coli K87-6相比其他2株菌株产量更高且营养物质的消耗量也较有优势，重组菌株E. coli K87-5存在生长受到抑制的缺陷。综合考虑选取重组菌株E. coli K87-6是理想菌株，可以用于工业大规模生产。

 4. 结论

本研究成功构建了高效合成聚唾液酸(PSA)的基因工程大肠杆菌株。通过对关键基因neuD进行不同拷贝数的过表达，验证了其对PSA合成的影响。结果表明，高拷贝数的neuD基因能显著提高PSA的产量，其中E. coli K87-6菌株在发酵罐中PSA产量最高，达到了8.4 g/L，比出发菌株E. coli K87提高了27%。此外，E. coli K87-6菌株在单位细胞的产率和营养物质的利用效率方面也表现出显著优势，表明其在工业大规模生产中的应用潜力。

 基金项目

本研究受到了齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程基础研究类项目(2023PY007)、山东省科技型中小企业创新能力提升工程(2023TSGC0525)、德州市重大科技创新工程项目(2023ZDYF010140)的资助。

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