同源重组(homology directed repair, HDR)是一种生物体生来就具有的细胞内修复DNA损伤的机制，由限制性内切酶、DNA连接酶等多种重组酶介导的多种重组系统，可使带有目标基因同源臂的外源DNA与目标基因发生基因重组，进而实现目的基因的精准敲除 [15] 。丝状菌在工业中广泛应用，研究者利用同源重组对微丝状菌进行改造以提高其生产性能，有研究显示 [16] ，丝状细菌、丝状酵母和丝状真菌是三大类工业丝状菌。丝状细菌主要包括工程丝状菌和天然放线菌，工程丝状菌可通过基因工程技术将细胞形态调节为丝状，以增加聚羟基脂肪酸酯、酶、海藻酸寡糖等天然产物的合成，用于工程丝状菌的基因工程主要涉及细胞分裂、细胞壁和寿命。天然放线菌通过孢子繁殖，并且以菌丝状生长，其与分生孢子能够共同形成分枝菌丝体，突变体筛选和基因工程技术常被用于改造放线菌，从而达到增强目的产物的合成的目的。丝状酵母可以形成胚芽孢子和假菌丝，以丝状形式生长，进一步提高细胞耐受性和基因工程能有效增强其生产效率。丝状真菌不同于丝状细菌和酵母，其具有真正的发达菌丝，主要包括曲霉属、根霉属、青霉属、毛霉属，常利用基因工程和突变体筛选进行改造。

目前，丝状真菌同源重组的研究主要是明确特定的基因功能、改变生物体特定产物的代谢途径、辅助明确调控机制和代谢机制等。同源重组敲出技术在改变代谢途径，提高目的产物产量方面的研究一直是一大研究热点，例如，Aigner团队使用丝状真菌中的里氏木霉菌株，通过Cre-loxP同源重组系统在丝状真菌中实现了多轮抗性筛选基因重复使用 [17] 。基于Cre-loxP的遗传系统删除oahA基因，并插入pyc、mdh3和C4二羧酸转运蛋白基因c4t318。由此产生的菌株在发酵罐中产生l-苹果酸的含量高达约200 g/L，同时还产生28 g/l柠檬酸和1.87 g/l富马酸 [18] 。明确基因功能以及明确合成与代谢机制是同源重组技术重要的作用之一。吕佳 [19] 运用利用同源重组的方式对丝状真菌基因组中Myrothecisin类化合物预测核心基因进行敲除，明确了两个负责调控myrothecisin E生物合成的基因，基于此进一步推测了myrothecisin E的合成途径。陈思羽 [20] 等利用同源重组法对丝状真菌中的两个光敏色素基因PaPhy1和PaPhy2进行基因定点敲除，发现两个光敏色素基因对丝状真菌有性生殖过程起正调节作用，对SOD酶活性和POD酶活性起负调节作用，突变型菌株的ROS含量改变，导致其衰老延缓、生命周期延长，将其作为工程菌株应用于纤维素降解中可能生产更多的纤维素降解酶。

利用同源重组进行基因敲除已经广泛应用于基因研究领域。在真核生物基因修复中，非同源末端连接占主导地位，同源重组发生概率极其低，并且外源DNA序列容易产生脱靶效应。非同源末端连接(Nonhomologous end joining, NHEJ)主要是依靠Ku和LigD两种蛋白质来完成DNA双链断裂的修复，NHEJ中Ku70或LigD基因的缺失，能够使基因靶向效率提高 [21] 。例如，Hidetoshi Nakamura等 [22] 主要研究了工业菌株ECDR基因的靶向效率，其结果表明，基因组编辑引入LigD突变能够有效提高A基因靶向效率。Xiulin Qin [23] 等为提高木质纤维素分解丝状真菌的基因靶向频率，删除了非同源端联基因LigD，其研究表明，PLigD基因的缺失可显著增加P中三个不同部位的GTF，并且敲除LigD基因所获得的产物在某些敏感性方面无明显缺陷。Ting Zhang [24] 等敲除了丝状真菌黄松的非同源重组通路中Ku70同系物，发现敲除Ku70同系物的基因所产生的黄松菌株的同源重组效率明显高于野生型菌株。同源重组的完成需要对大量的转化子进行多次筛选验证，步骤十分繁琐，并且工作量巨大，近年来已逐渐被操作更为简便的基因编辑、RNA干扰等技术所替代 [25] 。

随着人工核酸酶技术的不断发展，基因编辑技术已经日益成熟，发展出了三代技术，即ZFN、TALEN和CRISPR技术，根据Cas蛋白的类型，将CRISPR/Cas系统划分为三大类型，目前应用十分广泛的成熟类型是CRISPR/Cas9 [Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas (CRISPR associated 9)]，其属于Type II型。ZFN技术由锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)和FokI核酸内切酶组成。ZFP可以特异识别18 bp长度的DNA序列，两个锌指结构域与FokI核酸内切酶形成二聚体切开DNA双链，二聚化的FokI核酸内切酶在ZFP的引导下对DNA片段进行切割。ZFN技术通过设计两个ZFN对目的基因进行定点切割。二聚体非特异性结合时会由此造成脱靶现象，产生较强的细胞毒性，在一定程度上阻碍了ZFN的应用 [26] 。ZFN是二代基因编辑工具TALEN技术的基础，TALEN靶向基因敲除技术与ZFN靶向基因敲除技术的作用原理基本一致，结构也相似，TALEN是由Fok I核酸酶与DNA结合的结构域进行结合，TALEN中DNA结构域为转录激活因子样效应蛋白(TALE)，但ZFN的DNA结合域为ZFP。与ZFN相比，TALEN具有操作成本低、识别位点多样、作用效率高、细胞毒性小的优势 [27] [28] 。但TALEN有一定的限制，目前其很少应用于多基因敲除中，主要应用于单基因敲除。由于丝状真菌本身的遗传复杂性、技术的弊端限制等因素，ZFN和TALEN技术应用在丝状真菌中的研究较少。

相较于ZFN和TALEN技术，CRISPR技术具有显著优势，近年来已经成为丝状真菌研究中的一大热点。CRISPR-Cas9是第三代基因编辑工具，tracrRNA、核糖核酸酶III、crRNA和Cas9蛋白是CRISPR-Cas9的三大组成部分。tracrRNA和crRNA形成的tracrRNA-crRNA复合体和Cas9蛋白共同作用对双链DNA进行切割，诱发非同源性末端接合NHEJ修复机制。该机制通过引起错配，从而导致基因移码突变，最终实现基因敲除。CRISPR-Cas9基因敲除技术通过人工设计引导RNA (single guide RNA, sgRNA)来代替tracrRNA-crRNA复合体发挥作用，以此达到基因敲除的目的。CRISPR-Cas9基因编辑系统具有众多优点，其设计简单，sgRNA易获得且成本低，能同时作用于多个靶点实现多基因敲除。因此，CRISPR-Cas9系统自出现以后就受到广泛的关注和应用 [29] 。

Nødvig CS [30] 等构建了一个简单而多功能的丝状真菌CRISPR-Cas9系统，通过一系列实验表明了此系统可引入不同真菌物种的特定等位基因中，虽然使用相同的原间隔器来进行诱变，但不同物种的诱变效率差异较大。并且说明了RNA引导的诱变和基因靶向连续使用的可行性。值得注意的是，该研究表明CRISPR-Cas9技术可以在功能上适应丝状真菌的工作。CRISPR技术应用于丝状真菌可以准确地编辑基因，从而提高通路效率。例如，黑曲霉通过CRISPR-Cas9技术进行单碱基编辑，实现基因修饰。构建CRISPR-Cas9系统敲除pyrG和fwnA基因，效率为47%~100% [31] 。在此基础上，利用CRISPR通过功能缺失突变鉴定了转运蛋白CexA，构建的可诱导pmbfA的工程菌株基因表达表现出比组成型表达对照菌株更高的性能。最终，在诱导系统中获得了109 g/L的柠檬酸，与组成型表达系统相比提高了三倍 [32] 。CRISPR技术应用于丝状真菌有助于发现新的生物活性次生代谢物。László Mózsik [33] 等提出一种基于CRISPR激活方法的沉默基因组编辑的丝状真菌转录调控工具，将一个具有核缺陷的CAS9突变体(DCAS9)融合到一个高度活跃的三方激活剂VP64-P65-RTA (VPR)中，组成了与几个丝状真菌种类兼容的非整合性的AM-VECT，以实现SGNA定向靶向基因调控。其研究表明，基于MAM1的DCAS9-VPR融合表达可用于沉默BGCS的转录激活，文章提出了一个可以发现新的生物活性代谢物、鉴别抗菌剂等新型化合物的CRISPR工具，并指出该工具可以广泛用于激活丝状真菌中的沉默的生物代谢物合成基因集群。另外，丝状真菌的CRISPR系统优化具有重要研究意义。Yuzhen Li [34] 等以米曲霉ptrA作为对硫胺素抗性的选择标记，对含有AMA7自主复制序列的黄曲霉菌株构建了一种简单的CRISPR-Cas9基因组编辑系统，结果表明该系统在各种表型的黄曲霉基因敲除具有高转化率和高基因靶向效率，该系统可能广泛应用于曲霉菌中。Alberto Jiménez [35] 等使用CRISPR/Cas9系统对棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)进行了基因编辑，提出了一个用于棉阿舒囊霉的基因编辑新方法，展示了无标记的CRISPR-Cas9系统用于该菌株的效率，验证了该系统可用于处理可见和不可见表型的核苷酸缺失和替换，该系统已被验证为三种基因组编辑方法：基因失活、loxP疤痕的基因组敲除和点突变。该研究在很大程度上有助于以无标记的方式促进这种工业真菌的基因组操作。Song R [36] 等指出，在丝状真菌中建立CRISPR-Cas9系统遇到的问题通常涉及Cas9或sgRNA的表达、非工作的sgRNA、编辑效率、毒性、异地靶效应和阳性转化剂的选择。要实现CRISPR-Cas9系统在丝状真菌中的高效应用，可以从这些方面进行优化。

随机T-DNA插入突变法可以利用多种载体，插入大量的随机突变在目的细胞的基因组中，并且通过相应的标记进行筛选验证得到敲除目的基因的细胞。随机T-DNA插入突变法包括农杆菌介导的T-DNA插入突变技术和U-转座子插入突变技术，二者都可以用于植物细胞基因敲除，但转座子插入突变只适用于细胞内具有活性转位子的植物中。T-DNA插入突变已在真菌尤其是各种病原菌中广泛应用 [37] ，其相较于同源重组更加简便、高效，能够实现目的基因的定向敲除。目前，越来越多的研究者利用T-DNA插入突变研究拟南芥，水稻等植株，对其在丝状真菌中的研究较少。Guo Z [38] 等通过T-DNA整合得到丝状真菌突变体以研究丝状真菌C. magnum的致病性基因，在这种丝状真菌中发现了六个潜在的毒力基因，为研究丝状真菌致病机制奠定了基础。Zhang J [39] 等通过T-DNA插入将烯化酶基因插入到丝状真菌P6中，发现突变体在磷酸盐溶解方面受损。

RNA干扰(RNAi)是RNA分子介导的沉默机制，RNA干扰主要是利用siRNA、miRNA或piRNA与同源mRNA结合，诱导目的mRNA降解或抑制目的mRNA翻译，从而达到基因沉默。RNAi技术具有特异性、广谱性、高效性、系统性和环境安全性等优点 [40] ，但RNAi存在临时性、位置效应和不完全敲除的弊端，因此，RNAi不能完全取代同源重组技术 [41] 。由于原核细胞中存在共翻译的现象，故该策略广泛适用于真核生物的基因敲除。最早用于RNAi研究的生物中有一类丝状真菌Neurospora crassa，Li L [42] 等的研究阐述了此类丝状真菌两种RNAi途径中的多种机制以及其他丝状真菌中的RNAi防御机制，并且提出RNAi在丝状真菌中广泛保守，在理解基因功能和调节机制方面发挥重要作用。