1. 引言
[1]
。据调查，AIS约占所有脑卒中患者的69.6%~70.8%，以肢体运动和语言功能障碍为主要临床表现，全球疾病负担研究(GBD)数据显示，我国AIS发病率由2010年的129/10万上升至2019年的145/10万，其患病率由2010年的1100/10万上升至2019年的1256/10万，严重威胁着国民的健康
[2]
。
[3]
。从《太平惠民和剂局方》将只此两味药组成治疗产后中风的“芎归汤”，到如今临床上用于治疗AIS的舒脑欣滴丸，川芎、当归药一直是治疗中风的高频用药，且是核心药对
[4]
。川芎味辛，性温，归肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的功效，能“上行头目”，“主治中风入脑，头痛”，现代研究其在抗氧化、神经保护、调节血管稳态、抗炎等药理作用上效果显著
[5]
；当归味甘、辛、苦，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血的功效，可使气血各有所归，为内科补血之佳品，现已证实其可以调节血液循环、缺血后损伤保护、保护脑和神经
[6]
。两药配伍，具有互补作用，发挥生血、活血、行气的协同作用，当归可以制约川芎燥性；而川芎又能防止当归的滋腻
[7]
。但其对治疗AIS的机制需要更进一步的探索，故本研究利用网络药理学探索川芎–当归药对与AIS的相关性，预测作用靶点，分析其作用机制，并利用分子对接技术验证主要活性成分与核心靶点间的结合性，以期为川芎–当归药对治疗AIS提供理论依据，并为后续治疗AIS中成药的研究与开发拓宽思路。
2. 资料与方法
2.1. 川芎、当归活性成分及作用靶点筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) (
https://tcmsp-e.com/index.php
)检索“川芎、当归”的主要活性成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为条件筛选出其对应的作用靶点，将所得的作用靶点信息在UniProt数据库(
https://www.uniprot.org/
)中的“Homo sapiens”靶点数据相匹配，利用UniportKB功能，进一步将所有蛋白名称进行标准化，并进行校正、去重。
2.2. AIS疾病靶点的获取
以“Acute Ischemic Stroke”为检索词，在Genecards (
https://www.genecards.org/
)、DrugBank (
https://go.drugbank.com/
)、OMIM (
https://www.omim.org)、DisGeNET (
https://www.disgenet.org/)疾病数据库中，将获得的AIS疾病靶点并删除重复项。
2.3. 获取川芎–当归作用靶点与AIS疾病靶点的交集
将得到的药物作用靶点与AIS疾病靶点利用Venn工具(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/
)取交集。
2.4. “活性成分–疾病靶点”网络构建
将当归–川芎活性成分及AIS疾病靶点录入Cytoscape3.9.1软件，生成“活性成分–疾病靶点”网络图，再通过Network Analyzer方式，以Degree值筛选出当归–川芎药对作用于AIS疾病靶点的核心有效成分。
2.5. 蛋白质相互作用(PPI)网络构建
通过STRING数据库(
https://cn.string-db.org/
)中“Homo sapiens”设置信度 > 0.4，隐藏网络中的孤立节点，获得共同靶点的PPI网络，然后采用Cytoscape3.9.1软件进行网络拓扑分析，根据度值(即连接节点的数量)筛选出核心靶点。
2.6. GO功能与KEGG通路富集分析
将川芎–当归药对与AIS疾病的共同靶点导入DAVID数据库(hps:/davidncifcrtov/)，以Select Identifier进行生物学过程(BP)，Genelist与Background以“Homo sapiens”进行细胞组分(CC)、分子功能(MF)，及KEGG通路富集分析，在微生信网站(
http://www.bioinformatics.comcn/
)得出相应的富集分析气泡图。
2.7. 分子对接技术验证
http://wwwl.rcsb.org/
)下载相应的蛋白分子结构PDB格式文件。在TCMSP中下载当归–川芎药对核心有效成分分子结构的mol2格式文件。利用PyMol软件将核心靶点的蛋白分子去水，采用AutoDockTools-1.5.7软件将处理过的核心靶点的蛋白分子和当归–川芎药对核心有效成分分子加全氢，并保存为pdbqt格式文件。使用AutoDockTools-1.5.7软件将处理好的配体与受体进行分子对接，通过分子对接结果分析当归–川芎药对活性成分与核心靶点之间的结合活性，由对接结果的结合能评估受体和配体的对接情况。最后用PyMol软件将结合性最好的对接结果进行分析，并输出对接图，从数值中评价受体和配体的对接情况。
3. 结果
3.1. 川芎–当归活性成分含量测定
通过TCMSP数据库，以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为筛选条件，筛选出川芎7个活性成分，当归2个活性成分，具体详见
表1
。并检索得到9个活性成分对应靶点111个：β-谷甾醇对应靶点38个，豆甾醇对应靶点30个，谷甾醇对应靶点3个，富马酸对应靶点3个，十八碳二烯对应靶点3个，杨梅酮对应靶点25个，黑麦碱对应靶点4个，川芎萘呋内酯对应靶点4个，洋川芎醌没有对应靶点。经过去重和删除无效靶点，共获取川芎–当归药对的作用靶点69个。
Table 1
<xref></xref>Table 1. Chuanxiong angelica active ingredientTable 1. Chuanxiong angelica active ingredient 表1. 川芎–当归活性成分
中药
分子编号
分子名称
口服利用度
类药性
英文名称
中文名称
(OB)
(DL)
川芎
MOL001494
Mandenol
十八碳二烯
42.00%
0.19
MOL002135
Myricanone
杨梅酮
40.60%
0.51
MOL002140
Perlolyrine
黑麦碱
65.95%
0.27
MOL002151
Senkyunone
洋川芎醌
47.66%
0.24
MOL002157
Wallichilide
川芎萘呋内酯
42.31%
0.71
MOL000359
Sitosterol
谷甾醇
36.91%
0.75
MOL000433
FA
富马酸
68.96%
0.71
当归
MOL000358
Beta-sitosterol
β-谷甾醇
36.91%
0.75
MOL000449
Stigmasterol
豆甾醇
43.83%
0.76
3.2. AIS相关靶点检索
通过Gene Cards数据库检索，得到AIS疾病相关靶点3371个。
3.3. 川芎–当归与AIS的共同靶点
将3371个AIS疾病靶点与69个当归–川芎药对作用靶点取交集，共得到53个共同靶点，见
图1
。
Figure 1
Figure 1. Chuanxiong and Angelica sinensis for the treatment of AIS target--图1. 川芎–当归治疗AIS靶点韦恩图--
![]()
3.4. “活性成分–疾病靶点”网络构建
将川芎–当归作用靶点与AIS疾病的共同靶点录入Cytoscape3.9.1软件，生产出“活性成分–疾病靶点”网络图，具体信息详见
图2
。
图2
中，圆形部分为共同靶点，三角形部分为川芎–当归药对作用于AIS的活性成分。用连线表达其关联性，使用Network Analyzer方式得到有效成分的Degree值，数值越高的有效成分相关联靶点越多越重要。结果显示，有3个有效成分的Degree值大于10，其中杨梅酮(Myricanone)对应22个靶点，β-谷甾醇(Beta-sitosterol)对应20个靶点，豆甾醇(Stigmasterol)对应10个靶点，谷甾醇(Sitosterol)、川芎萘呋内酯(Wallichilide)和黑麦碱(Perlolyrine)各对应2个靶点。因此认为杨梅酮、β-谷甾醇和豆甾醇为川芎–当归药对治疗AIS疾病的关键活性成分。
Figure 2
Figure 2. Chuanxiong and Angelica sinensis active ingredient disease target network--图2. 川芎、当归“活性成分–疾病靶点”网络--
![]()
3.5. PPI网络图及核心靶点分析
将53个共同靶点录入STRING数据库，通过Cytoscape3.9.1软件，产生232条相互作用关系，平均度值(Degree)为8.75。建立PPI网络(
图3
)。再用“cytoHubba”获取前5的核心靶为JUN、ESR1、CASP3、PTGS2、NR3C1。以Degree值由大至小排序，生成可视化网络图(
图4
)。
Figure 3
Figure 3. PPI network of potential targets for treating ais with Chuanxiong and Angelica sinensis--图3. 川芎–当归治疗AIS潜在靶点的PPI网络--
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Figure 4
Figure 4. The core target of Chuanxiong and Angelica sinensis for the treatment of AIS--图4. 川芎–当归治疗AIS的核心靶点--
![]()
3.6. GO功能富集分析
将53个共同靶点录进DAVID数据库，富集分析GO功能，并采用P值排序，选择前10条目GO功能，制作富集气泡图。结果显示：细胞组分(CC)主要位于膜筏、膜微域、突触前膜等；分子功能(MF)主要表达在发挥蛋白质结合、蛋白激酶结合、转录因子结合、类固醇结合、蛋白酶结合和细胞因子受体结合等分子功能；生物学过程(BP)主要涉及有机环状化合物的反应、对激素的反应、对刺激的反应、细胞凋亡和血液循环系统过程等生物学过程，从而起到治疗AIS的作用，见
图5
。
3.7. KEGG通路富集分析
图6
。将其导入Cytoscape3.9.1软件，生成“活性成分–疾病靶点–信号通路”网络图(
图7
)。
图7
中，三角形节点代表药物活性成分，圆形节点代表信号通路，长方形节点代表作用靶点。
Figure 5
(a)--(b)--(c)--Figure 5. GO functional enrichment analysis bubble diagram. (a) GO-CC; (b) GO-MF; (c) GO-BP--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程
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Figure 5
(a)--(b)--(c)--Figure 5. GO functional enrichment analysis bubble diagram. (a) GO-CC; (b) GO-MF; (c) GO-BP--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程
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Figure 5
(a)--(b)--(c)--Figure 5. GO functional enrichment analysis bubble diagram. (a) GO-CC; (b) GO-MF; (c) GO-BP--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程--图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程
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图5. GO功能富集分析气泡图。(a) GO-细胞组分；(b) GO-分子功能；(c) GO-生物学过程
Figure 6
Figure 6. Bubble diagram of KEGG pathway--图6. KEGG通路富集气泡图--
![]()
Figure 7
Figure 7. “Components-targets-pathways” network of Chuanxiong-angelica--图7. 川芎–当归“成分–靶点–通路”网络--
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3.8. 分子对接技术验证
表2
。由“2.5”的PPI网络图，可知川芎–当归药对治疗AIS疾病的核心靶点有JUN、ESR1、CASP3、PTGS2等。使用AutoDock软件，将川芎–当归药对核心活性成分与各自的核心靶点进行分子对接，并根据其结合能来评价对接效果。通常，如果结合能<−17.79 kJ/mol，则表明该配体对受体具有一定的结合活性，如果<−20.93 kJ/mol，则表明该配体对受体具有较好的结合活性，如果<−29.30 kJ/mol，则表明该配体对受体具有较强的结合活性(引用)。从
表3
可以看出，β-谷甾醇(beta-sitosterol)与CASP3的结合性最好，杨梅酮(Myricanone)与ESR1的结合性也较强，借助PyMol软件来显示结合能(≤−20.93 kJ/mol)的对接结果，如
图8
所示。
Table 2
<xref></xref>Table 2. Comparison table of core componentsTable 2. Comparison table of core components 表2. 核心成分对照表
成分名称
MOL ID
成分来源
Beta-sitosterol
MOL000358
当归
Stigmasterol
MOL000449
当归
Myricanone
MOL002135
川芎
Stigmasterol
MOL000359
川芎
Table 3
<xref></xref>Table 3. Docking results of core components and target moleculesTable 3. Docking results of core components and target molecules 表3. 核心成分与重要靶点分子对接结果表
成分
靶蛋白
PDB ID
结合能/(KJ/mol)
杨梅酮(Myricanone)
ESR1
1SJ0
−32.46784
PTGS2
5IKR
−24.09984
β-谷甾醇(beta-sitosterol)
CASP3
1QX3
−35.02008
JUN
6Y3V
−25.98264
豆甾醇(stigmasterol)
JUN
6Y3V
−29.79008
PTGS2
5IKR
−27.90728
Figure 8
(a)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId34.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId35.jpeg?20240913102139" /></p>(b)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId36.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId37.jpeg?20240913102140" /></p>(c)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId38.jpeg?20240913102139" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId39.jpeg?20240913102139" /></p>(d)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId40.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId41.jpeg?20240913102139" /></p>(e)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="//www.abtbus.com/html/file/2272080-rId42.jpeg?20240913102139" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId43.jpeg?20240913102139" /></p>
![]()
Figure 8
(a)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId34.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId35.jpeg?20240913102139" /></p>(b)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId36.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId37.jpeg?20240913102140" /></p>(c)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId38.jpeg?20240913102139" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId39.jpeg?20240913102139" /></p>(d)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId40.jpeg?20240913102140" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId41.jpeg?20240913102139" /></p>(e)<p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="//www.abtbus.com/html/file/2272080-rId42.jpeg?20240913102139" /></p><p class="imgGroupCss_v"><img class=" imgMarkCss lazy" data-original="https://html.hanspub.org/file/2272080-rId43.jpeg?20240913102139" /></p>
![]()
(f)
图8. 分子对接示意图。(a)：杨梅酮- ESR1；(b)：杨梅酮-PTGS2；(c)：β-谷甾醇-CASP3；(d)：β-谷甾醇-JUN；(e)：豆甾醇-JUN；(f)：豆甾醇-PTGS2
4. 小结
AIS容易致残甚至致死，且会反复发作，现代医学认为其机制较为复杂，主要涉及兴奋性氨基酸、钙离子、自由基失调，引发炎性反应，使得神经细胞凋亡及自噬等生理病理过程
[8]
。
本研究发现当归、川芎药对治疗AIS的关键活性成分是杨梅酮、β-谷甾醇、豆甾醇。β-谷甾醇可以通过作用于细胞的相关信号通路来调节生长与凋亡、抗氧化性
[9]
。β-谷甾醇能减少TNF、IL-1β和IL-6的释放，从而抑制炎症反应
[10]
。杨梅酮具有抗氧化和保护神经的作用，从而改善AIS患者的症状
[11]
。豆甾醇具有免疫调节作用，提升AIS患者抗炎因子IL-10水平，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌，能减轻大脑缺血再灌注后的炎症反应对神经的损害，从而改善预后
[12]
。
根据“活性成分–疾病靶点”的网络构建与分析，核心靶点是JUN、ESR1、CASP3、PTGS2。这些靶点主要涉及免疫炎症反应、细胞自噬凋亡等生物学过程。JUN可以调节免疫反应和细胞凋亡相关靶点表达，可能参与大脑炎症反应的调控
[13]
。ESR1可以参与细胞炎性因子表达和调节免疫反应
[14]
。CASP3是细胞凋亡中起关键作用的酶，可以调控AIS脑组织的细胞凋亡
[15]
。PTGS2为前列腺素的类过氧化物酶，能催化花生四烯酸转化，是重要的炎性介质，可以参与脑损伤后的炎性反应，其过量表达可以破坏大脑稳态，并促使脑梗死面积的扩大
[16]
。
在KEGG通路富集解析中，靶点主要表达的信号通路为钙信号通路、PI3K-AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路是一种细胞内信号转录途径，接收细胞外信号因子，通过下游丝氨酸及苏氨酸的磷酸化，发挥调控细胞凋亡和细胞自噬，促进血管生成的作用
[17]
。其在AIS中扮演着重要的角色
[18]
，PI3K磷酸化激活AKT形成p-AKT，调节下游mTOR蛋白表达，同时p-AKT还能够促进一氧化氮的合成，抑制凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9等的表达，进而降低转录因子核因子-κB的活性，减少炎症反应的发生，从而抑制细胞凋亡
[19]
。同时PI3K/AKT信号通路也是调控细胞自噬的经典信号通路。细胞自噬是细胞自我保护的代谢途径之一，在AIS早期，PI3K/AKT/mTOR的激活能够调控细胞自噬及合成蛋白质，具有维持细胞稳态的作用，能够促进细胞存活和血管新生，但过度自噬也会造成细胞死亡
[20]
。程永杰等
[21]
发现当归可以激活PI3K/AKT通路，促进血管生成，抑制炎症反应，减少脑缺血再灌注引起的脑梗死体积及改善血–脑屏障通透性。杜旌畅等
[22]
发现川芎可以激活PI3K-Akt信号通路，上调PI3K p85与p-Akt的表达，减轻大脑缺血半暗带的水肿。可知，当归、川芎可以通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制AIS后脑组织细胞凋亡与细胞自噬，减少脑水肿及脑梗死体积，促进血管新生，改善血–脑屏障通透性。
综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接方法，分析当归、川芎药对的活性成分、关键靶点和分子通路机制，发现当归、川芎药对中多种有效成分协助作用于多靶点、多通路，通过减少炎性因子表达，抑制细胞凋亡等方式改善AIS的临床表现，为治疗AIS提供了一定思路，为其临床应用提供更多的可行性。