从高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus data base, GEO)数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )中下载了23种癌症的单细胞转录组测序(Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)数据集，包括头颈部腺样囊性癌(Adenoid Cystcarcinoma of the Head and Neck, ACC)胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)、非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NCSLS)、结肠癌(Colorectal cancer, COAD)、肾透明细胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)、乳腺癌(Breast invasive carcinoma, BRCA)、肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)、卵巢癌(Ovarian cancer, OV)、甲状腺癌(Thyroid carcinoma, THCA)、胃癌(Stomach adenocarcinoma, STAD)、食管鳞状细胞癌(Esophageal carcinoma, ESCA)、胰腺癌(Pancreatic adenocarcinoma, PAAD)、膀胱癌(Bladder Urothelial Carcinoma, BLCA)、肾脏嫌色细胞癌(Kidney Chromophobe, KICH)、口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)、肾乳头状细胞癌(Kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP)、肉瘤(Sarcomav, SARC)、子宫内膜样癌(Uterine Corpus Endometrial Carcinoma, UCEC)、睾丸癌(Testicular Germ Cell Tumors, TGCT)、胆管癌(Cholangiocarcinoma, CHOL)、肝细胞癌(Liver hepatocellular carcinoma, LIHC)、直肠癌(Rectum adenocarcinoma, READ)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma, DLBC)。33种癌症类型的The Cancer Genome Atlas (TCGA)转录组数据均从UCSC XENA网站( https://xenabrowser.net/datapages/ )下载。仅选择有总生存期数据的患者进行进一步的数据分析。从Genotype-Tissue Expression(GTEx)数据库下载健康样本的转录组数据。利用R软件的Seurat包进行单细胞分析，排除基因表达数小于50的细胞以及线粒体基因表达占比大于30%的细胞。对质控后的细胞进行归一化和标准化。然后进行主成分分析(principal components analysis, PCA)，利用均匀流形近似和投影(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)对细胞聚类进行可视化。根据已知得细胞类型标记基因对每个细胞簇进行细胞注释。

在GeneCards数据库( https://www.genecards.org/ )中，鉴定出636个与坏死性凋亡相关的基因。将相关系数阈值设置为大于或等于1.0，得到102个与坏死性凋亡相关的基因。

使用AddModuleScore函数基于Genecards下载的坏死性凋亡基因相关性大于1的102个基因进行打分，根据得分的平均数，将细胞分为高分组和低分组。利用FindMarkers函数筛选log2FoldChange > 0.5的差异表达基因。将筛选出的标志基因与已知的坏死性凋亡基因取交集，得到每个癌症的坏死性凋亡相关基因。

将每个scRNA-seq数据坏死性凋亡高分组和低分组细胞进行随机抽样，每个肿瘤数据高分组和低分组各随机抽取125个样本，合并数据共计2875个样本。利用R的sva包的ComBat函数将样本进行去批次，随后拆分数据为训练集(n = 4600, 80%)和测试集(n = 1150, 20%)。利用泛癌的scRNA-seq数据相关坏死性凋亡的基因特征构建预测模型，分别应用三种机器学习算法进行模型构建。三种机器学习算法是支持向量机递归特征消除(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination，SVM-RFE，R包e1071)、基于Boruta特征选择算法的随机森林(Random Forest，RF，R包caret)、最小绝对收敛和选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO，R包glmnet)。

Boruta特征选择算法与RF结合进行标志物筛选。Boruta通过比较原始特征和其随机变量之间的表现来确定对目标变量有显著影响的特征。利用Boruta筛选出的特征构建RF模型，RF可以评估每个特征在构建决策树时的重要性筛选特征。LASSO通过对目标函数添加L1正则化项，倾向于产生稀疏权重向量，从而使得部分特征的权重变为零，进行特征选择。SVM-RFE是基于SVM的特征选择方法，通过RFE的方式来选择最重要的特征子集。SVM通过找到一个最优的超平面来将不同类别的数据分隔开，同时最大化间隔，以提高泛化能力。使用SVM对所有特征进行建模评估，得到每个特征的权重，根据特征的重要性，逐步剔除权重较小的特征，重新构建模型，直到达到设定的特征数量或停止条件，得到最佳的特征子集。

基于5折交叉验证，通过ROC曲线下的面积(Area Under Curve, AUC)指标评估机器学习模型性能。AUC是ROC曲线下的面积，ROC曲线横轴表示假阳率(False Positive Rate, FPR)，纵轴表示真阳率(True Positive Rate, TPR)。ROC曲线展示了在不同分类阈值下，模型的灵敏度和特异度之间的权衡关系。AUC值越接近1，说明模型性能越好，具有更好的分类能力；AUC值为0.5时，则表示模型的分类效果等同于随机猜测。AUC作为评价二分类模型性能的重要指标，在实际应用中被广泛使用。将三种机器学习模型筛选结果取交集，得到泛癌相关坏死性凋亡的生物标志物。

为进行NCPS.Sig基因集通路富集分析，基于TCGA泛癌普通转录组数据(bulk RNA-seq, bulk-seq)的归一化基因表达数据，利用R的GSVA包进行打分。基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis, GSVA)是一种用于基因表达数据分析的方法，可用于评估基因集在不同样本中的得分。通过将基因表达数据转化为基因集水平的表达变化，可以更好地捕捉基因集的生物学含义和功能，帮助理解基因调控网络、信号通路等方面的生物学过程。通过基因表达数据计算基因集的得分，对得到的基因集得分进行统计分析，比较不同样本之间基因集的得分差异。坏死性凋亡基因特征NCPS.Sig的GSVA得分根据中位数，将泛癌bulk-seq数据集中的样本分为高坏死性凋亡肿瘤样本和低坏死性凋亡肿瘤样本。评估NCPS.Sig的GSVA得分在正常样本和泛癌肿瘤样本之间的表达差异。

基因本体论(Gene Ontology, GO)是一种用于描述基因和蛋白质功能的标准化注释体系，将生物学过程(biological processes, BP)、细胞组分(cellular components, CC)和分子功能(molecular functions, MF)分为不同的术语和层级结构。通过R的cluster Profiler包对NCPS.Sig基因集进行功能富集分析，可视化p值小于0.05的相关术语。随后使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)分析MsigDB下载的坏死性凋亡相关通路上基因集的表达情况。

TMB反映了肿瘤细胞基因组中的突变数量，与肿瘤的遗传多样性和进化速度相关 [14] 。高TMB的肿瘤通常伴随着更多的新抗原的产生，会被免疫系统识别并引发免疫反应，高TMB可能与较好的临床预后相关。MSI是肿瘤组织中DNA错配修复功能缺陷的结果，MSI高的肿瘤往往预示着更好的治疗效果 [15] 。TMB和MSI数据来自GDC (Genomic Data Commons, https://portal.gdc.cancer.gov/ )数据库，利用TCGAbiolinks包下载泛癌的TMB数据，进行TMB与NCPS.Sig打分的相关性分析。MSI数据来自cBioPortal数据库( https://www.cbioportal.org/ )预测与NCPS.Sig得分的相关性。对于免疫细胞浸润的评估，根据TCGA肿瘤队列的转录组数据，使用CIBERSORT算法来评估NCPS.Sig评分与TCGA队列中不同癌症类型的22个免疫细胞浸润的相关性。

利用NCPS.Sig评分和来自TCGA数据库的泛癌症临床数据，通过单变量Cox分析研究了NCPS.Sig与肿瘤预后之间的关系。计算了相对p值和危险比，并绘制了森林图。随后，采用R包survminer针对基因集评分生成了各种类型肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线。

利用深度神经网络Cox模型DeepSurv分析生存数据 [14] ，验证NCPS.Sig在预后的预测效果。DeepSurv是一种深度前馈神经网络，具有多个隐藏层并加入了整流线性单位(ReLU)、批处理归一化、dropout层、权重衰减正则化等技术。隐藏层由全连接的节点层和dropout交叠组成，以增强模型的泛化性能和避免过拟合。加入ReLU非线性激活函数用于学习复杂的模式和特征，提高模型非线性拟合能力，它的形式为：

$f\left(x\right)=\{\begin{array}{c}x,x>0\\ 0,x\le 0\end{array}$(1)

整合输出后得到风险率 ${\hat{h}}_{\theta }\left(x_i\right)$，用于估计Cox模型中的交叉熵损失函数：

$l\left(\theta \right):=-\frac{1}{N_{E=1}}{\displaystyle \underset{i:E_i=1}{\sum }\left({\hat{h}}_{\theta }\left(x_i\right)-\log {\displaystyle \underset{j\in R\left(T_i\right)}{\sum }{e}^{{\hat{h}}_{\theta }\left(x_j\right)}}\right)}+\lambda \cdot {\Vert \theta \Vert }_2^2$(2)

其中， $N_{E=1}$是患者样本数， $E$为生存状态， $T$为生存时间， $x$是特征变量， $\lambda$是L2正则化的参数，通过参数权重 $\theta$预测患者基因表达量对风险率的影响。

将K-M生存分析显著的TCGA数据库的肿瘤类型包括UVM、LGG、PRAD、LIHC、LUAD、KIRC、HNSC、MESO的基因表达数据和临床数据输入DeepSurv模型，共4360个样本。将样本分为训练集(80%，3488个样本)和测试集(20%，872个样本)进行预测。参数设置3层隐藏层，每层由全连接层、Batch normalization、激活层(ReLU)、dropout层堆叠组成，学习率为1e−2，L2正则化参数为1e−4。采用适应性矩估计(Adaptive Moment Estimation, Adam)算法，根据每个参数的梯度情况来动态调整学习率，它维护了每个参数两个额外的变量：一阶矩估计和二阶矩估计，用来估计梯度的均值和方差。同时，采用Cox比例风险回归模型和随机森林生存分析模型与DeepSurv进行对比，Cox比例风险模型基于风险比例假设，即各个预测因子对风险的影响在时间上是恒定的。Cox风险回归模型如下：

$h\left(t|x_i\right)=h_0\left(t\right)\exp \left(x_i\beta \right)$(3)

$x=\left(x_{i1},x_{i2},\cdots ,x_{in}\right)$代表预测因子，表示可能与生存时间相关的协变量。 $h_0\left(t\right)$表示当所有危险因素均为0时的基线风险率。 $\beta$表示Cox模型的偏回归系数，需根据实际样本数据进行估计。在Cox比例风险回归中，通常通过部分似然估计来预测模型的参数 $\beta$，从而推断不同因素对生存时间的影响。随机森林生存分析模型是一种结合了随机森林和生存分析的方法，用于处理生存数据和预测生存时间。每棵决策树都会针对生存数据进行训练，考虑个体的生存时间和相关因素。利用AUC值比较模型性能，并验证NCPS.Sig基因集在预后的作用。

假设泛癌中与坏死性凋亡的转录组变化是癌症的生存预后和免疫治疗靶点。为了证明，下载了23种肿瘤的scRNA-seq数据，以及坏死性凋亡相关基因集NCPS。将scRNA-seq数据质控后，进行手动细胞注释，并通过UMAP可视化，如 图1(a)~(d) 所示。利用NCPS基因集评估单细胞肿瘤数据，将细胞分为高表达坏死性凋亡基因组High和低表达坏死性凋亡组Low。随后基于AddModuleScore打分分析各细胞簇得分显示，T细胞得分高于单核细胞、B细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞簇。因此t细胞表现出最高的坏死性凋亡水平。

从Genecards数据库下载的坏死性凋亡相关的基因集，共636个基因，筛选出相关性大于1的102个基因命名为NECR.Sig，对细胞进行打分。基于打分将细胞分为高低组，进行差异基因分析，将各肿瘤数据筛选出的差异表达基因与NECR.Sig取交集得到NECR.UP.Sig基因集，共58个基因。将NECR.UP.Sig基因集输入机器学习模型，如 图2 所示，LASSO回归模型从NECR.UP.Sig鉴别出46个基因，经过5折交叉验证，AUC值为0.74。通过Boruta特征选择后的随机森林模型识别出44个基因，AUC值为0.78。SVM-RFE识别出55个相关基因。将三个模型鉴别的基因通过韦恩图取交集，得到包含34个基因的泛癌相关坏死性凋亡的基因集，命名为NCPS.Sig ( 图2 )。

为了探讨泛癌中NCPS.Sig的生物学特性。利用GSVA评估NCPS.Sig，计算TCGA数据库中33种癌症的每个患者的转录组特征得分。随后对GTEx数据库中的正常样本进行打分，分析正常样本和肿瘤样本的基因表达差异。由 图3 所示，肿瘤样本中GSVA高分组比例较高，正常样本中低分组占比更高。 图3(a) 显示，在33种癌症数据中，共有21个肿瘤数据正常样本和肿瘤样本基因表达差异显著，并且其中19个NCPS.Sig评分肿瘤样本都高于正常样本，包括HNSC、PAAD、LIHC等肿瘤类型，但LUSC和KICH的正常样本评分高于肿瘤样本。

对NCPS.SIG基因集进行功能通路富集分析，GO富集分析显示基因集在多种生物学过程、细胞组分和分子功能中富集，包括模式识别受体、调节凋亡信号通路、程序性细胞凋亡。由 图4 所示，NCPS.Sig中多个基因都参与程序性细胞凋亡和调节凋亡信号通路的生物学过程。

高NCPS.Sig GSVA评分与肿瘤免疫浸润的相关性，这种转录组特征也增加了预测抗PD-L1/PD-1免疫检查点抑制剂治疗反应的可能性。TMB和MSI是免疫治疗反应的一个强有力的泛癌预测因子 [16] 。我

图4. NCPS.Sig基因集富集分析。(a-b) GO富集分析；(c) GSEA分析基因集在凋亡通路的表现

们评估了NCPS.Sig与TMB之间的相关性。11种肿瘤与TMB显著相关，并且THYM、STAD、PAAD等7种癌症呈正相关。STAD与MSI也呈正相关。随后，使用CIBERSORT来评估GSVA评分与TCGA队列中不同癌症类型的22个免疫细胞浸润的相关性。 图5 显示，较高的GSVA评分与免疫细胞明显改变的肿瘤浸润有关。特别是，几乎所有癌症类型的GSVA评分与M2巨噬细胞肿瘤浸润呈正相关，与T细胞滤泡辅助性细胞肿瘤浸润呈负相关。因此，我们认为坏死性凋亡相关的转录组特征，可作为免疫细胞反应失衡的泛癌预后因子。

图5. 与坏死性凋亡评分相关的肿瘤免疫特性。(a-b) NCPS.Sig评分与TMB和MSI的相关性雷达图；(c) NCPS.Sig得分与泛癌的22种免疫细胞相关性。红色代表正相关，蓝色代表负相关，点越大代表相关性越高。p值 < 0.05为*, p值 < 0.01为**，p值 < 0.001为***

利用NCPS.Sig基因在TCGA泛癌数据中使用Cox比例风险回归模型( 图6(a) )。结果显示，共有10种癌症的GSVA评分与预后显著相关。UVM、THYM等9种癌症显示高评分的样本与不良预后相关。还可以观察到，NCPS.Sig评分对包括HNSC、KIRC、LGG、LIHC、LUAD、MESO、PAAD、UVM在内的各种其他癌症类型的总生存率具有很强的预后能力( 图6(b)~(i) )，表明我们选择的基因集评分在各种癌症中是可靠的预后指标。

图6. 坏死性凋亡评分的预后价值。(a) NCPS.Sig的泛癌COX分析森林图。(b)~(i) NCPS.Sig打分在泛癌的生存分析曲线图

为了验证所获得的NCPS.Sig基因特征对预测泛癌患者预后风险的能力，在8种癌症的TCGA队列上构建了一个DNN分类模型DeepSurv。在该模型中，以NCPS.Sig基因集作为输入，以生存状态作为分类标签。测试集模型(TCGA队列)的AUC为0.894。此外，在随机生存森林和COX比例风险回归模型中验证基因特征的可靠性，AUC值分别为0.894和0.649 ( 图7 )。结果表明基因集可作为预测患者预后风险的有效生物标志物。