hjmce Hans Journal of Medicinal Chemistry 2331-8287 2331-8295 beplay体育官网网页版等您来挑战！ 10.12677/hjmce.2024.123020 hjmce-92761 Articles 医药卫生, 化学与材料 吡嗪类SHP2抑制剂的设计、合成及生物活性评价
Design, Synthesis and Biological Activity Evaluation of Pyrazine SHP2 Inhibitors
陈 卓 1 堵桐弘 1 吕遐师 1 李沛峰 2 赖宜生 1 中国药科大学新药研究中心，多靶标天然药物全国重点实验室，江苏 南京 中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 30 07 2024 12 03 175 184 6 4 ：2024 7 4 ：2024 7 5 ：2024 Copyright © 2024 beplay安卓登录 All rights reserved. 2024 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ SHP2是一个肿瘤治疗的潜在靶点。本文以TNO155为先导化合物，采用基于片段的药物设计策略，设计并合成三个系列共11个新型吡嗪类SHP2变构抑制剂，其结构均经 1H-NMR和ESI-MS谱确证。采用荧光分析方法，通过替代底物DiFMUP的去磷酸化程度对目标化合物开展体外活性评价。结果表明，目标化合物对SHP2蛋白显示不同程度的抑制活性。其中2个化合物C-2和C-3的活性较为突出，值得进一步研究。
Eleven novel pyrazine SHP2 allosteric inhibitors were designed and synthesized in three series based on TNO155 of Novartis, drug design strategy based on fragments and molecular docking technology of computer-aided drug design. Their structures were confirmed by 1H-NMR and ESI-MS spectra. The in vitro activity of DiFMUP was evaluated by fluorescence analysis. The results showed that the target compounds showed different degrees of inhibitory activity on SHP2. Among them, two compounds, C-2 and C-3, have outstanding activity and deserve further study.
蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP2抑制剂，TNO155，生物活性
Protein Tyrosine Phosphatase
SHP2 Inhibitor TNO155 Biological Activity 1. 引言

SHP2是由PTPN11基因编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，在多种组织的细胞质中广泛表达，特异性地催化细胞质中磷酸酪氨酸的去磷酸化过程。SHP2是PTP家族中首个被证实的原癌蛋白，是生长因子和免疫检查点相关信号通路的关键节点和调节因子，参与Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT、PI3K/AKT/mTOR和PD-1/PD-L1等多条信号通路的调控 [1] 。SHP2功能异常与多种肿瘤的发生和发展密切相关，因此成为肿瘤治疗的潜在靶点 [2] 。早期靶向SHP2的药物研发主要集中在正构抑制剂，但由于PTP活性位点的高度保守、高极性和带电环境，导致靶向催化域的抑制剂存在效力弱、选择性低和透膜性差等不足 [3] 。直到2016年，诺华公司报道了首个SHP2变构抑制剂SHP099 [4] ，改变了以往针对PTP催化域的设计策略，为SHP2抑制剂的研发带来了曙光。随后该公司在SHP099的基础上进行结构优化，得到第一个进入临床开发的SHP2变构抑制剂TNO155 [5] 。诺华公司的开创性工作吸引了多家药企跟进。其中，加科思公司以TNO155为模板进行结构优化，获得了两款候选变构抑制剂JAB-3068和JAB-3312 [6] ，近期JAB-3312与KRASG12C抑制剂戈来雷塞联合用药正在启动III期临床试验，成为首个进入III期开发的SHP2变构抑制剂。总而言之，TNO155的发现为SHP2变构抑制剂的研究提供了新的思路( 图1 )。

Figure 1. Structures of representative SHP2 allosteric inhibitors--图1. 代表性SHP2变构抑制剂的结构-- <xref></xref>2. 目标化合物的设计与合成 2.1. 目标化合物的设计

诺华公司通过高通量筛选和结构改造得到SHP099 [4] ，但是该化合物具有光毒性和hERG抑制作用，为此研发人员对其进行优化得到候选药物TNO155 [5] 。X-射线共晶结构(PDB ID: 7JVM)显示，TNO155处于SHP2隧道状变构口袋中。其中，吡嗪环上的N原子与Arg111形成氢键相互作用，环上的氨基与Glu250形成氢键相互作用；吡啶环与Arg111形成阳离子-π堆积作用，环上的氨基通过周围的水分子间接与Lys492形成相互作用；而螺环片段则处在隧道状变构口袋末端的极性区域，其环上的氨基经质子化后分别与Thr108、Glu110和Phe113形成关键性氢键网络。然而，螺环片段的合成难度大，并且可供改造的空间小，同时考虑到碱性脂肪伯胺往往会导致较高的hERG抑制作用，从而带来心脏毒性风险 [4] 。因此，我们尝试对螺环片段进行改造，拟采用羧基及其衍生化基团替代螺环胺基，同时改变氮杂脂肪环的大小和羧基取代的位置，为此设计并合成了A~C系列目标化合物( 图2 )。

Figure 2. Design of target compounds A, B and C--图2. A、B和C系列目标化合物的设计策略--

A系列目标化合物的合成：2-氨基-3-溴-6-氯吡嗪作为起始原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与3-巯基丙酸-2-乙己酯偶联制得硫醚1，在碱性条件下经逆Michael反应生成中间体2。2与3-氯-4-碘-2-吡啶胺偶联得到3，然后与L-脯氨酸甲酯偶联得到中间体4，最后4经水解制得A-1，A-1经酰胺化制得A-2。4与水合肼反应得到A-3 ( 图3 )。

Reagents and conditions: (a) 2-octyl-3-mercaptopropionate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 105˚C, 4 h; (b) t-BuOK, EtOH, 0˚C, 1 h; (c) 3-chloro-4-iodopyridin-2-amine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 75˚C, 10 h; (d) (3S)-(-)-amino- pyrrolidine, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (e) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (f) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (j) hydrazinium hydroxide, MeOH, r.t.--Figure 3. Synthetic route for target compounds A-1~A-3--

B系列目标化合物的合成：以3为原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与3-哌啶甲酯制得中间体5，经LiOH水解制得B-1，B-1经酰胺化制得B-2。B-1与N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺反应制得中间体6，6脱Boc保护得到B-3。3与3-(Boc-氨基)哌啶偶联制得中间体7，7脱Boc保护得到B-4 ( 图4 )。

C系列目标化合物的合成：以3为原料，在Pd2(dba)3/Xantphos催化下与4-哌啶甲酸甲酯制得中间体8，经水解制得C-1，C-1经酰胺化得到C-2。3与4-Boc-氨基哌啶偶联得到中间体9，经三氟乙酸脱Boc保护后制得C-3。3与4-(Boc-氨甲基)哌啶偶联得到中间体10，经三氟乙酸脱Boc保护后制得C-4 ( 图5 )。

Reagents and conditions: (a) methyl piperidine-3-carboxylate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (b) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (c) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (d) N-Boc-ethylenediamine, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (e) TFA, DCM, r.t., 1 h. (f) 3-(Boc-amino)piperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (j) TFA, DCM, r.t., 1 h.--Figure 4. Synthetic route for target compounds B-1~B-4-- Reagents and conditions: (a) methyl isonipecotate, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (b) LiOH, H2O, THF, r.t., 2 h; (c) NH4Cl, HATU, DIEA, DMF, r.t., 4 h; (d) 4-Boc-aminopiperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h; (e) TFA, DCM, r.t., 1 h; (f) 4-(Boc-aminomethyl)piperidine, Pd2(dba)3, Xantphos, DIEA, 1,4-dioxane, 120˚C, 6 h.--Figure 5. Synthetic route for target compounds C-1~C-4-- 2.2. 目标化合物的合成

化合物熔点采用RY-1型熔点仪测定；1H-NMR使用ACF-300 MHz核磁共振仪测定，TMS为内标；ESI-MS使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap (SL)质谱仪测定。所有试剂未经特别说明均为市售化学纯或分析纯产品。

将2-氨基-3-溴-6-氯吡嗪(1.00 g, 4.80 mmol)溶于1,4-二氧六环(12 mL)中，加入3-巯基丙酸-2-乙己酯(1.10 g, 5.04 mmol)、Xantphos (56 mg, 0.10 mmol)、Pd2(dba)3(44 mg, 0.05 mmol)和DIEA (1.24 g, 9.59 mmol)，在氮气氛围下105℃搅拌4 h。减压浓缩，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到黄色油状液1 (1.60 g，收率96.4%)。MS (ESI) m/z：346.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.71 (s, 1H)，6.78 (s, 2H)，4.07~4.00 (m, 2H)，3.96~3.93 (m, 2H)，3.31 (t, J = 5.1 Hz, 2H)，2.72 (t, J = 5.1 Hz, 2H)，1.57~1.46 (m, 1H)，1.35~1.19 (m, 8H)，0.88~0.81 (m, 6H)。

将化合物1 (1.60 g, 4.63 mmol)溶于无水乙醇(8 mL)中，氮气氛围中于0℃下加入叔丁醇钾(1.04 g, 9.25 mmol)，继续于冰浴下搅拌1 h，减压浓缩得到化合物2后立即投入下步反应。

将化合物2 (0.92 g, 4.63 mmol)溶于1,4-二氧六环(14 mL)中，分别加入3-氯-4-碘-2-吡啶胺(1.18 g, 4.36 mmol)、Xantphos (54 mg, 0.10 mmol)、Pd2(dba)3(42 mg, 0.05 mmol)和DIEA (1.20 g, 9.25 mmol)，在氮气氛围下75℃搅拌10 h。减压浓缩，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到黄色固体3 (1.1 g，收率80.3%)。MS (ESI) m/z：288.0 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.88 (s, 1H)，7.70 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.15 (s, 2H)，6.37 (s, 2H)，5.97 (d, J = 5.4 Hz, 1H)。

将化合物3 (0.15 g, 0.52 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入L-脯氨酸甲酯盐酸盐(0.13 g, 0.78 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到浅粉色固体4 (0.10 g，收率50.4%)。MS (ESI) m/z：288.0 [M + H]+。

将化合物4 (100 mg, 0.26 mmol)溶于四氢呋喃(1.5 mL)中，加入氢氧化锂(13 mg, 0.53 mmol)的水溶液(0.5 mL)，室温搅拌2 h。浓缩后加入5 mL水，浓盐酸调pH至4，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体A-1 (83 mg，收率86.3%)，mp. 174.6℃~176.4℃。MS (ESI) m/z：367.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.54 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.31 (s, 1H)，6.25 (s, 2H)，6.08 (s, 2H)，5.72 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.48 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H)，3.54 (dt, J = 15.9, 9.6 Hz, 2H)，2.34~1.96 (m, 4H)。

将化合物A-1 (47 mg, 0.13 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (73 mg, 0.19 mmol)和DIEA (33 mg, 0.32 mmol)，室温搅拌0.5 h。加入氯化铵(69 mg, 1.28 mmol)，继续反应3.5 h。加入水，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体A-2 (32 mg，收率68.3%)，mp. 177.9℃~179.3℃。MS (ESI) m/z：366.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.43 (s, 1H)，7.25 (s, 1H)，7.06 (s, 1H)，6.27 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.73 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.31 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H)，3.65 (dt, J = 15.9, 9.6 Hz, 2H)，2.25~1.91 (m, 4H)。

将化合物4 (70 mg, 0.18 mmol)溶于无水甲醇(1.5 mL)中，加入水合肼(138 mg, 2.76 mmol)，室温搅拌12 h。减压浓缩，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体A-3 (45 mg，收率64.3%)，mp. 173.6℃~175.2℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 9.16 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.26 (s, 1H)，6.27 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.45~4.20 (m, 3H)，3.70~3.50 (m, 2H)，2.22~1.84 (m, 4H)。

将化合物3 (0.35 g, 1.21 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入哌啶-3-羧酸甲酯(0.26 g, 1.82 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到浅粉色固体5 (0.33 g，收率68.8%)。MS (ESI) m/z：395.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.63 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.60 (s, 1H)，6.22 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.39~4.34 (m, 1H)，4.05~4.00 (m, 1H)，3.63 (s, 3H)，3.22~3.08 (m, 3H)，2.05~1.40 (m, 4H)。

将化合物5 (300 mg, 0.76 mmol)溶于四氢呋喃(3 mL)中，加入氢氧化锂(36 mg, 1.52 mmol)的水溶液(1 mL)，室温搅拌2 h。浓缩后加入5 mL水，浓盐酸调pH至4，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体B-1 (220 mg，收率76.0%)，mp. 175.3℃~176.9℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 12.33 (s, 1H)，7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.62 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.40~4.35 (m, 1H)，4.06~4.02 (m, 1H)，3.15~2.99 (m, 2H)，2.46~2.41 (m, 1H)，2.01~1.97 (m, 1H)，1.76~1.40 (m, 3H)。

将化合物B-1 (60 mg, 0.16 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (90 mg, 0.24 mmol)和DIEA (41 mg, 0.32 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入氯化铵(84 mg, 1.58 mmol)，继续反应3.5 h。异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体B-2 (46 mg，收率76.9%)，mp. 179.6℃~181.3℃。MS (ESI) m/z：380.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，7.37 (s, 1H)，6.87 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.40 (d, J = 13.2 Hz, 1H)，4.26 (d, J = 13.2 Hz, 1H)，2.95~2.83 (m, 2H)，2.35~2.25 (m, 1H)，1.95~1.85 (m, 1H)，1.80~1.70 (m, 1H)，1.65~1.40 (m, 2H)。

将化合物B-1 (90 mg, 0.24 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (108 mg, 0.28 mmol)和DIEA (61 mg, 0.47 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入N-Boc-1,2-乙二胺(45 mg, 0.28 mmol)，继续反应3.5 h。乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体6 (60 mg，收率48.5%)。MS (ESI) m/z：523.2 [M + H]+。

将化合物6 (60 mg, 0.12 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体B-3 (25 mg，收率51.5%)，mp. 203.4℃~205.0℃。MS (ESI) m/z：423.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 8.07 (s, 1H)，7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.20 (s, 2H)，6.13 (s, 2H)，5.73 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.34 (t, J = 16.5 Hz, 2H)，3.03~2.74 (m, 5H)，2.40~2.30 (m, 1H)，1.95~1.90 (m, 1H)，1.81~1.56 (m, 2H)，1.50~1.35 (m, 2H)，1.24 (s, 2H)。

将化合物3 (50 mg, 0.17 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.5 mL)中，加入3-(Boc-氨基)哌啶(52 mg, 0.26 mmol)和DIEA (1 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体7 (48 mg，收率61.2%)。MS (ESI) m/z：452.2 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.19~4.05 (m, 2H)，3.01~2.94 (m, 2H)，2.85~2.82 (m, 1H)，1.94~1.90 (m, 1H)，1.75~1.71 (m, 1H)，1.50~1.42 (m, 2H)，1.40 (s, 9H)。

将化合物7 (45 mg, 0.10 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体B-4 (32 mg，收率91.3%)，mp. 182.7℃~184.4℃。MS (ESI) m/z：352.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.19~4.05 (m, 2H)，3.01~2.94 (m, 2H)，2.85~2.82 (m, 1H)，1.94~1.90 (m, 1H)，1.75~1.71 (m, 1H)，1.48~1.40 (m, 2H)，1.23 (s, 2H)。

将化合物3 (100 mg, 0.35 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.6 mL)中，加入哌啶-4-羧酸甲酯(75 mg, 0.52 mmol)和DIEA (1.2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体8 (89 mg，收率64.9%)，MS (ESI) m/z：395.1 [M + H]+。

将化合物8 (89 mg, 0.23 mmol)溶于四氢呋喃(1.5 mL)中，加入氢氧化锂(11 mg, 0.45 mmol)的水溶液(0.5 mL)，室温搅拌2 h。浓缩，浓盐酸调pH至4，用异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-1 (64 mg，收率74.6%)，mp. 178.4℃~180.1℃。MS (ESI) m/z：381.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.1 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.24 (s, 2H)，6.14 (s, 2H)，5.76 (d, J = 5.1 Hz, 1H)，4.24 (d, J = 13.2 Hz, 2H)，3.10~2.95 (m, 2H)，1.94~1.88 (m, 2H)，1.65~1.45 (m, 2H)，1.25~1.20 (m, 1H)。

将化合物C-1 (52 mg, 0.14 mmol)溶于DMF (1 mL)中，加入HATU (78 mg, 0.21 mmol)和DIEA (35 mg, 0.27 mmol)，室温搅拌0.5 h。随后加入氯化铵(73 mg, 1.37 mmol)，继续反应3.5 h。异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩滤液，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-2 (22 mg，收率42.4%)，mp. 182.6℃~184.4℃。MS (ESI) m/z：380.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H),7.63 (s, 1H)，7.30 (s, 1H)，6.80 (s, 1H)，6.25 (s, 2H)，6.12 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.34 (d, J = 13.2 Hz, 2H)，2.95~2.86 (m, 2H)，1.83~1.75 (m, 2H)，1.60~1.45 (m, 2H)，1.26~1.22 (m, 1H)。

将化合物3 (50 mg, 0.17 mmol)溶于1,4-二氧六环(0.5 mL)中，加入4-(Boc-氨基)哌啶(52 mg, 0.26 mmol)和DIEA (1 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。冷却，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体9 (48 mg，收率61.2%)。MS (ESI) m/z：452.2 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.24~4.19 (m, 2H)，3.01~2.93 (m, 2H)，2.90~2.83 (m, 1H)，1.87~1.70 (m, 2H)，1.39 (s, 9H)，1.36~1.29 (m, 2H)。

将化合物9 (55 mg, 0.12 mmol)溶于无水二氯甲烷(1 mL)中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌1 h。减压浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-3 (40 mg，收率93.4%)，mp. 185.2℃~187.0℃。MS (ESI) m/z：352.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.64 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.23 (s, 2H)，6.10 (s, 2H)，5.74 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.24~4.19 (m, 2H)，3.01~2.93 (m, 2H)，2.90~2.84 (m, 1H)，1.87~1.70 (m, 2H)，1.36~1.14 (m, 4H)。

将化合物3 (135 mg, 0.47 mmol)溶于1,4-二氧六环(1 mL)中，加入3-(Boc-氨甲基)哌啶(100 mg, 0.47 mmol)和DIEA (2 mL)，氮气氛围下120℃反应6 h。反应液冷却至室温后加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩滤液，柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯 = 1:1)，得到酒红色固体10 (165 mg，收率75.9%) MS (ESI) m/z：466.2 [M + H]+。

将化合物10 (165 mg, 0.35 mmol)溶于无水二氯甲烷(2 mL)中，加入三氟乙酸(1 mL)，室温搅拌1 h。浓缩，碳酸氢钠调pH至8，异丙醇–二氯甲烷(1:3)混合溶剂萃取，饱和食盐水洗涤，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡黄色固体C-4 (68 mg，收率52.5%)，mp. 191.8℃~193.3℃。MS (ESI) m/z：366.1 [M + H]+；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，7.63 (s, 1H)，6.26 (s, 2H)，6.11 (s, 2H)，5.75 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，4.23 (td, J = 11.1, 10.1, 4.8 Hz, 2H)，3.01~2.86 (m, 2H)，2.80~2.63 (m, 2H)，1.90~1.60 (m, 3H)，1.53~1.41 (m, 2H)，1.25 (s, 2H)。

 3. 生物活性评价

SHP2通过双磷酸化酪氨酸(pTyr)肽与其SH2结构域结合而被变构激活。此激活步骤导致SHP2蛋白的自抑制构象发生改变，从而使N-SH2域与PTP域分离而暴露出催化位点，暴露的催化位点能够与底物识别并催化其发生去磷酸化反应 [1] 。SHP2的催化活性可采用快速荧光分析方法，通过替代底物DiFMUP的去磷酸化程度进行监测。该磷酸酶反应于37℃下在384孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面中进行，最终反应体积为100 μL，并采用60 mM HEPES (pH = 7.2)、75 nM NaCl、75 nM KCl、1 nM EDTA、0.05% P-20、5 mM DTT 作为分析缓冲条件。用100% DMSO将受试化合物配制为一系列浓度梯度的溶液，实验设置最大组(SHP2 + IRS1 + DiFMUP)、最小组(SHP2 + DiFMUP)、测试组(SHP2 + IRS1 + DiFMUP + 受试化合物)和对照组(SHP2 + DiFMUP + 受试化合物)阳性对照组为TNO155。将受试化合物与0.5 nM的SHP2和1 μM的激活肽IRS1-pY1172在室温下于反应液中共同孵育1小时，随后将10 μM替代底物DiFMUP添加到反应液中，并继续在室温下孵育30分钟。采用Tecan多功能酶标仪340 nm激发波长和450 nm激发波长的监测反应液的荧光信号，根据荧光比值计算化合物对蛋白结合的抑制率。实验结果如 表1 所示。

<xref></xref>Table 1. Inhibitory activity of target compounds A-1~A-3, B-1~B-4 and C-1~C-4 against SHP2Table 1. Inhibitory activity of target compounds A-1~A-3, B-1~B-4 and C-1~C-4 against SHP2 表1. 目标化合物A-1~A-3，B-1~B-4和C-1~C-4对SHP2的抑制活性

Compound

R

Inhibition rate (%)

at 10 μmol/L

SHP2

IC50(μM)

A-1

13.74

ND

A-2

5.57

ND

A-3

14.91

ND

B-1

37.20

ND

B-2

13.95

ND

B-3

59.18

2.21

B-4

23.09

ND

C-1

12.18

ND

C-2

52.81

3.74

C-3

86.80

0.10

C-4

78.59

0.51

TNO155

97.98

0.032

ND：未检测。

 4. 结果与讨论

本文设计并合成了11个未见文献报道的吡嗪类目标化合物，其结构均经1H-NMR和ESI-MS确证。从 表1 的活性数据可以看出，目标化合物在10 μmol/L浓度下对SHP2蛋白的作用均显示不同程度的抑制活性，其中C-3和C-4的活性相对突出，其IC50值分别为0.10 μM和0.51 μM，值得进一步研究。

从 表1 的数据可以获得以下构效关系规律：1) 从整体来看，C系列目标化合物的活性整体优于A系列和B系列(e.g. A-2 vs B-4 vs C-3)；2) A系列目标的羧基、氨基、酰胺基取代化合物活性均不高(e.g. A-1 vs B-1和A-2 vs C-3)；3) B系列化合物中氨基取代类活性较好，提示氨基质子化后能够与蛋白形成稳定的相互作用(e.g. B-1 vs B-2 vs B-4)；4) 从B、C系列化合物中，不难看出取代基位置与化合物活性强弱有关，提示氨基构象影响其与蛋白之间相互作用(e.g. B-2 vs C-2和B-4 vs C-3)。

为了进一步说明目标化合物的构效关系，我们通过Maestro和PyMOL，选取了活性最好的C-3进行分子对接实验。结果如 图6 所示，C-3处于SHP2蛋白的变构口袋中，其中哌啶环上的氨基质子化后，能够与Thr108、Glu110和Phe113形成氢键相互作用网络，Arg111与吡嗪环的阳离子-π堆积作用以及Arg111与吡嗪环上的N原子形成氢键作用力仍然存在，吡嗪环上的氨基同样与Glu250形成氢键。在对比C-3和B-4对接结果时，发现B-4化合物右侧氨基的构象阻碍右侧氨基与Phe113氢键作用的形成，证明了Phe113是活性必需氨基酸。综上所述C-3与靶蛋白的结合模式和TNO155相似，这些相互作用力的存在，可能是C-3活性较其他化合物活性高的原因。

Figure 6. Binding modes of C-3 and B-4 with target proteins (PDB ID: 7JVM)--图6. C-3和B-4与靶蛋白的结合模式(PDB ID: 7JVM)-- 5. 结论

本文拓展了SHP2变构抑制剂结构的多样性，采用拼接策略设计并合成了11个吡嗪类化合物，所有化合物对SHP2都有一定的抑制作用，其中3-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫代)-6-(4-氨基哌啶-1-基)吡嗪-2-胺(C-3)表现出较好的抑制活性，遗憾的是，该化合物不如阳性化合物TNO155活性高。在分析化合物的构效关系后，发现右侧片段上的氨基能够影响化合物的生物活性，表明该结构是活性所必需的，为后续针对左侧结构优化的研究提供更多理论支持。

 基金项目

国家自然科学基金项目(22277142)。

 NOTES

*通讯作者。

 References Yuan, X.R., Bu, H., Zhou, J.P., et al. (2020) Recent Advances of SHP2 Inhibitors in Cancer Therapy: Current Development and Clinical Application. Journal of Medicinal Chemistry, 63, 11368-11396. >https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c00249 LaRochelle, J.R., Fodor, M., Vemulapalli, V., Mohseni, M., Wang, P., Stams, T., et al. (2018) Structural Reorganization of SHP2 by Oncogenic Mutations and Implications for Oncoprotein Resistance to Allosteric Inhibition. Nature Communications, 9, Article Number 4508. >https://doi.org/10.1038/s41467-018-06823-9 Scott, L.M., Lawrence, H.R., Sebti, S.M., et al. (2010) Targeting Protein Tyrosine Phosphatases for Anticancer Drug Discovery. Current Pharmaceutical Design, 16, 1843-1862. >https://doi.org/10.2174/138161210791209027 Garcia Fortanet, J., Chen, C.H., Chen, Y.P., Chen, Z., Deng, Z., Firestone, B., et al. (2016) Allosteric Inhibition of SHP2: Identification of a Potent, Selective, and Orally Efficacious Phosphatase Inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry, 59, 7773-7782. >https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b00680 LaMarche, M.J., Acker, M., Argintaru, A., Bauer, D., Boisclair, J., Chan, H., et al. (2020) Identification of TNO155, an Allosteric SHP2 Inhibitor for the Treatment of Cancer. Journal of Medicinal Chemistry, 63, 13578-13594. >https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01170 Ma, C., Gao, P., Chu, J., et al. (2017) Novel Heterocyclic Derivatives Useful as SHP2 Inhibitors. WO2017211303A1.
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