选用45只SPF级C57BL/6雄性小鼠(25~30 g)，利用线栓法制备MCAO/R小鼠模型。小鼠饲养于温度(19~25)℃，湿度为(50~60)%的环境中，自由摄食和水，昼夜周期为12 h。本实验已通过伦理委员会审核。

BCA蛋白定量试剂盒、Lipofectamine 2000、Trizol、青链霉素混合液(100 U/ml)、RI-PA裂解液(Invitrogen公司)；逆转录与实时定量PCR试剂；实时定量PCR引物及DAPI染液(上海生工)。miR-133bagomir及空白对照试剂、荧光酶检测试剂盒；兔抗小鼠RhoA抗体、大鼠抗小鼠claudin-5、ZO-1抗体(上海生工)；HRP标记的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗等试剂。

小鼠分为3组(n = 15)：miR-133bagomir组(侧脑室注射miR-133b agomir)；假手术组(sham) (侧脑室注射生理盐水)；agomir NC组(对照组) (侧脑室注射agomir NC)。4%水合氯醛经腹麻醉(0.1 ml/10g)小鼠后，参考小鼠脑解剖图谱，注射位点：前囟后0.5 mm，中线右侧1.0 mm。采用微量注射器自颅骨表面垂直进针2.0~3.0 mm，将miR-133b agomir或agomir NC或等量生理盐水注入小鼠侧脑室。注射完毕后拔出微量注射器，青霉素处理后缝合切口。

小鼠用1.5%异氟醚吸入麻醉后，仰卧固定在加热垫上，使之保持37℃，并监测小鼠血压、心率等数据。颈部做正中切口，经过一系列分离操作，将线栓插入颈外动脉，将线栓扭转插至颈内动脉颅内段，阻断大脑中动脉(MCA)血流，采用激光多普勒血流仪监测小鼠血MCA流变化，血流下降至基线值25%以下，认为成功阻断小鼠MCA血流。将线栓与颈外动脉共同结扎以固定线栓并将切口缝合。90 min后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，再次暴露切口，将线栓退出，激光多普勒仪监测血流上升至基线值50%以上视为灌注成功，术后给予保暖维持小鼠体温。持续灌注24 h后再进行后续实验。假手术组小鼠进行类似手术，只穿线不结扎。一部分小鼠分离取脑切片进行免疫组化；另一部分用于提取RNA和蛋白。

参照既往评估方法，小鼠再灌注24 h后，采用悬挂实验测试握力评估神经功能缺损。具体过程：将小鼠前爪横挂在线上(50 cm × 0.15 cm)，3分(两爪均能挂住)；2分(一爪能挂住)；1分(两爪均不能挂住)。每只小鼠测评3次，取平均值。记录悬挂时间并评分如下：0~4 s (0分)、5~9 s (1分)、10~14 s (2分)、15~19 s (3分)、20~24 s (4分)、25~29 s (5分)、≥30 s (6分)。将各项评分相加，得分越低者，提示神经功能缺损越严重。

小鼠再灌注后，吸入异氟醚深度麻醉下快速断头取脑，做冠状切片后放入2%TTC溶液中，37℃孵育20 min，然后固定于4%多聚甲醛中。次日扫描拍照，采用图像分析软件对图像进行分析，计算脑体积。

脑体积 $V=\frac{{\displaystyle {\sum }_i\left(C_i-N_i\right)}}{2\left({\displaystyle {\sum }_i{C}_i}\right)}\times 100$，其中C_i为健侧半球面积，N_i为梗死侧半球的非梗死面积。

利用伊文思兰渗透法评估血脑屏障通透性。MCAO处理后再灌注21 h时，将4%伊文思兰溶液(20 mg/kg)经小鼠股静脉注入。按照常规的实验方法断头取脑。将两侧脑组织分离，分别称重并匀浆，超速离心后取上清液，用酶标仪检测出波长并用公式A620 nm − [(A500 nm + A740 nm)/2)]/mg湿重作为每个样本的定量值。

采用Trizol法提取小鼠脑组织总RNA，分光光度计检测RNA浓度。按照RT-PCR常规步骤进行。以U6为待测miRNA的内参。实验重复3次。RT-PCR引物序列见 表1 。

按上述方法将小鼠麻醉后，快速将小鼠胸膛剪开并采血，利用4%的多聚甲醛持续灌注直到小鼠周身僵直为止，将取出的小鼠大脑置于4%多聚甲醛中固定6~8 h，30%的蔗糖脱水、包埋、连续冠状切片(厚度15~25 μm)。然后PBS漂洗、封闭1 h，加入稀释的一抗claudin-5 (1:500)、ZO-1 (1:500)、RhoA (1:300)于4℃孵育过夜，PBS漂洗、细胞核复染30 s后，采用PBS清洗，然后用显微镜观察拍照。

提取各组小鼠缺血半暗区皮层脑组织总蛋白。BCA法进行蛋白定量，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转至PVDF膜，封闭2 h，分别加入一抗：claudin-5 (1:500)、ZO-1 (1:500)、RhoA (1:300)，4℃孵育过夜。以HRP标记的二抗(1:500)室温孵育1 h。以目标蛋白与内参β-actin比值作为其相对含量。实验重复3次。凝胶成像仪进行曝光拍照并行条带灰度值分析。

采用GraphPadPrism 5.0和SPSS 19.0进行统计学分析，数据采用均数 ± 标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析的Dunnett’s或Bonferroni’s多重比较方法，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。

小鼠经过脑缺血再灌注处理后，分别采集小鼠血液样本与缺血半暗区脑皮质组织，RT-PCR检测发现，与假手术组小鼠比较，MCAO/R小鼠缺血半暗区及血浆中miR-133b表达水平显著低( 图1 )。

图1. miR-133b在急性缺血再灌注小鼠缺血半暗带(a)与血浆(b)与中的表达

伊文思蓝渗透实验表明，与agomir NC组小鼠比较，miR-133bagomir组小鼠梗死区伊文思蓝渗透显著减少( 图2 )与假手术组比较，miR-133b agomir组小鼠皮层组织中miR-133b表达显著增加，而agomir NC组小鼠脑内miR-133b表达显著降低，提示在小鼠脑内miR-133b成功过表达( 图3 )。与agomir NC组小鼠比较，miR-133b agomir组小鼠脑梗死体积显著减小( 图4 )；miR-133b agomir组小鼠神经功能缺损程度评分值较假手术组和agomir NC组均显著降低( 表2 )。

免疫组化和Western blot实验表明，与agomir NC组小鼠比较，miR-133b agomir组小鼠缺血半暗区中脑组织RhoA表达显著降低，claudin-5、ZO-1表达显著升高(P < 0.05)；与假手术组小鼠比较，agomir NC组小鼠缺血半暗区脑组织的RhoA表达显著升高，claudin-5、ZO-1表达显著下降(P < 0.05) ( 表3 )。

与Sham组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与Agomir NC比较，#P < 0.05。

续表

与Sham组比较，^▲P < 0.05，^▲▲P < 0.01；与agomir NC组比较，^#P < 0.05，^##P < 0.01。