本研究使用胰腺癌原发肿瘤的scRNA-seq数据对胰腺癌的肿瘤微环境进行研究，数据收集于Gene Expression Omnibus (GEO)数据库( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )，入藏号为GSM6603325。还收集了Cancer Genome Atlas (TCGA)的PAAD的RNA-seq表达谱数据和生存信息，数据通过GDC [12] ( https://portal.gdc.cancer.gov )进行下载。此外，收集了GEO数据库中urothelial cancer (UC)患者的数据进行验证，入藏号为GSE32894。

使用R包Seurat [13] (version 4.1.0)对scRNA-seq数据的原始计数矩阵进行预处理。首先，根据以下标准进行质量控制，过滤低质量细胞和基因：1) 过滤掉在至少95% 的细胞中都没有表达的基因以及表达的基因数少于5%的细胞；2) 保留线粒体基因表达小于15%的细胞；3) 保留核糖体基因表达大于3%的细胞；4) 保留红细胞基因表达小于0.1%且log10GenesPerUMI > 0.8的细胞；5) 使用DoubletFinder包对双细胞进行检测和过滤。随后，使用NormalizeData函数进行标准化处理并利用FindVariableFeatures函数筛选出前2000个高度可变基因并采用ScaleData函数进行归一化处理。最终，利用PCA (Principal Component Analysis)进行降维并使用FindNeighbors函数和t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) 分别对细胞进行聚类和可视化，将不同种类的细胞分开并将相似的细胞聚在一起。此外，细胞群的标志基因是利用FindMarkers函数鉴定的，鉴定标准是基因表达量的倍数变化(Fold change, FC)的对数logFC > 0.25且P < 0.05。根据每个亚群的标记基因的logFC值进行降序排列，选取每个上皮细胞亚群logFC值前10的标志基因绘制表达量热图。

使用SingleR [14] 软件包对细胞类型进行自动标注，SingleR可以基于给定已知标签的样本作为参考数据集，并根据与参考数据集的相似性来注释未知细胞。随后，从CellMarker网站( http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/index.jsp )获取某些特定细胞类型的标志基因，细胞及其标志基因分别为：T细胞(CD3D，CD3E，CD8A，CD4)；B细胞(CD79A，MS4A1)；巨噬细胞(CD68，CD163，CD14)；单核细胞(S100A9，S100A8)；成纤维细胞(FGF7，MME，DCN)；肌成纤维细胞(ACTA2)；内皮细胞(PECAM1，VWF)；上皮细胞(EPCAM，KRT19，PROM1)；肥大细胞(MS4A2)；神经细胞(MAP2)。使用SingleR软件包进行注释后，基于上述基因在不同细胞群中的表达量进行手动注释，验证注释结果，确保细胞注释的准确性。

CopyKAT [15] 利用细胞的基因表达数据来推断基因组拷贝数和亚克隆结构。该方法通过综合应用贝叶斯方法，鉴定出单细胞中的全基因组非整倍性，从而区分二倍体(Diploid)和非整倍体(Aneuploidy)细胞，并将后者视为肿瘤细胞。将上皮细胞提取出来进行重新聚类后，使用CopyKAT (version 1.1.0)区分上皮细胞中的肿瘤细胞和非恶性细胞。

基因集富集分析 [16] (Gene set variation analysis, GSVA)是在非参数无监督的条件下，对基因集数据进行富集分析。GSVA分析通常利用MSigDB [17] (Molecular Signatures Database)数据库( https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp )提供的基因集进行，同时也支持用户自定义基因集。MSigDB数据库目前包含H和C1-C8共九个预定义基因集类别，我们选用H基因集进行分析，该类别含有50个基因集，涵盖了DNA修复、细胞凋亡和缺氧等多个生物学过程。使用GSVA (version 1.42.0)软件包进行富集分析，以H基因集和上皮细胞的表达矩阵作为数据输入，计算每个上皮细胞在50个基因集中的富集分数，并进行相应的可视化。

拟时序分析是一种通过单细胞转录组数据，模拟和推断细胞在时间上的发展过程的方法，可以揭示细胞在发育、分化或其他生物过程中的动态变化，推断发育过程细胞的分化轨迹或细胞亚型的演化过程，在生物学研究中具有重要意义。首先利用Monocle3 [18] (version 1.3.1)内置的UMAP聚类方法对上皮细胞进行聚类，UMAP是一种非线性降维和数据可视化技术，在高维数据的可视化和聚类分析中得到了广泛应用。它通过保持数据点之间的局部拓扑结构，将高维数据映射到低维空间，实现数据的降维和可视化。随后，对上皮细胞的肿瘤细胞簇和非恶性细胞簇进行拟时序分析。在该过程中，以非恶性细胞簇为起始点，推断出上皮细胞的发育轨迹，并利用莫兰指数(一种用于衡量基因表达变化显著性的指标)筛选出在发育轨迹中变化最显著的基因。

基于R包CellChat [19] (version 1.6.1)进行细胞间通信分析。利用scRNA-seq数据，使用CellChat定量推断和分析细胞间通信网络，通过计算每个信号通路相关的所有相互作用的通信概率，确定主要调节不同信号通路的输出通信模式，并根据每个相互作用对所对应的信号通路，推断每个细胞亚群可能参与的信号通路以及相应的生物学功能。最后，在信号通路水平上鉴定所有细胞亚群的通讯模式，以探究不同的细胞亚群如何协同参与众多的信号通路。

使用survival软件包对TCGA数据库中获得的172个BLCA患者样本进行生存分析。首先，使用单变量Cox比例风险回归(Univariate Cox proportional hazards regression)分析，筛选出与患者总生存期显著相关的预后基因。随后，使用多变量Cox比例风险回归(Multivariate Cox proportional hazards regression)分析构建风险评分(Risk score)模型，如公式(1)所示：

$\text{Risk score}=\underset{i}{\overset{n}{{\displaystyle \sum }}}{\beta }_i\times {\exp }_i$ (1)

其中，β_i和Exp_i分别代表基因i的多变量Cox回归系数(Multivariate Cox regression coefficient)和表达水平，n代表预后基因的数量。接着，利用中位数将患者分为高危组(High-risk)和低危组(Low-risk)，使用survival ROC软件包绘制受试者工作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲线，并计算ROC曲线下面积(Area under ROC curve, AUC)。此外，还绘制了Kaplan-Meier (K-M)生存曲线，并进行对数秩检验 (Log-rank test)，以评估两组患者在总生存期上的差异。

原始scRNA-seq数据包括11949个细胞，质量控制后得到9013个细胞。通过对scRNA-seq数据进行聚类和细胞注释，最终得到7种细胞类型，如 图1(a) 所示，包括661个内皮细胞、940个成纤维细胞、6498个上皮细胞、270个巨噬细胞、547个T细胞、40个神经细胞和57个肥大细胞。

由于尿路上皮膀胱癌中癌细胞主要来源于上皮细胞，进一步提取了上皮细胞进行深入分析。上皮细胞进行降维和聚类后，被分为8个细胞亚群，如 图1(b) 所示。随后，将上皮细胞进一步分类为肿瘤细胞和正常上皮细胞，结果如 图1(c) 所示：在6498个上皮细胞中，包含2816个肿瘤细胞、2717个正常细胞和965个不能确定良恶性的细胞，大部分上皮细胞呈现恶性状态。根据细胞良恶性鉴定结果，8个上皮细胞簇中包括3个正常细胞簇、4个恶性细胞簇和1个不能确定良恶性的细胞簇，如 图1(d) 所示：正常细胞簇包括正常亚群1 (normal subpopulation 1, nor1)、正常亚群2 (normal subpopulation 2, nor2)和正常亚群3 (normal subpopulation 3, nor3)；肿瘤细胞簇包括肿瘤亚群1 (tumor subpopulation 1, tum1)、肿瘤亚群2 (tumor subpopulation 2, tum2)、肿瘤亚群3 (tumor subpopulation 3, tum3)和肿瘤亚群4 (tumor subpopulation 4, tum4)；不能确定良恶性的细胞簇(not.defined)。

为了研究上皮细胞肿瘤内的异质性，对4个上皮细胞恶性细胞簇进行差异分析，鉴定每个恶性上皮细胞亚群的标志基因，结果如 图2(a) 所示。在tum1中，OLFM4基因和CRISP3基因的表达水平较高：OLFM4基因可以促进胰腺癌细胞的增殖 [20] ；CRISP3基因与细胞的生长和迁移有关 [21] 。在tum2中，ERO1A基因、FTH1基因和TIMP2基因的表达水平较高：ERO1A基因具有糖酵解依赖性生长促进作用，并可以由缺氧诱导 [22] ；FTH1基因与癌症免疫有关 [23] ；TIMP2基因与炎症有关 [24] 。在tum3中，STMN1基因、H2AFZ基因和TIMP2基因的表达水平较高：STMN1基因与胰腺癌的增殖和迁移有关 [25] ；H2AFZ基因可以促进肿瘤细胞的增殖和生长，进而推动肿瘤的转移和上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT) [26] 。在tum4中，CCL4基因和IL7R基因的表达水平较高：CCL4基因与细胞免疫有关，可以促进肿瘤的发展 [27] ；IL7R基因具有很强的免疫调节作用，可直接或间接作用于肿瘤细胞 [28] 。

通过对上皮细胞簇进行富集分析，探究了上皮细胞亚群的特征及生物学功能，结果如 图2(b) 所示。与促进癌细胞增殖有关的的基因集(HEDGEHOG_SIGNALING, BILE_ACID_METABOLISM)在tum1亚群中富集，胆汁酸和胆盐可以通过一系列信号转导途径介导炎症，促进肿瘤增殖，抑制肿瘤细胞凋亡 [29] [30] 。tum2亚群富集参与血管形成、血红素代谢和红细胞分化功能的基因集(Angiogenesis)，肿瘤细胞的生长和组织浸润需要新的血管持续形成，有助于肿瘤获取氧气和营养，在肿瘤的进展、侵袭和转移中起着重要作用 [31] 。此外，缺氧(Hypoxia)相关基因集在tum2中也呈上调状态，缺氧可以促进肿瘤表现出更具特征性的恶性行为，可以通过诱导缺氧诱导因子1-α (HIF-1α)等分子促进新血管生成，以及通过多种途径影响免疫系统 [32] 。在tum3亚群中，与细胞增殖相关的基因集(MYC_TARGETS_V2, MYC_TARGETS_V1)呈现富集状态，MYC是一种转录因子，能够促进细胞的生长增殖和迁移，还能影响细胞的凋亡过程 [33] [34] 。在tum4亚群中，炎症和免疫相关的基因集(TNFA_SIGNALING_VIA_NFK, TGF_BETA_SIGNALING)呈上调状态。核因子κB (Nuclear factor kappa B, NFκB)是协调炎症反应以及细胞分化、增殖和存活的重要调节因子，与恶性肿瘤的风险增加以及大多数类型癌症的恶性进展有关。

为了深入研究肿瘤亚群的演变过程，我们对上皮细胞进行了拟时序分析，结果如 图3 所示。首先进行了聚类，如 图3(a) 所示。随后揭示了从非恶性细胞到恶性细胞的逐步演变过程，如 图3(b) 所示，依照nor3，nor1，nor2，not.defined，tum2，tum1，tum4，tum3次序演变。

将拟时序分析结果与GSVA分析结果进行整合分析。发现肿瘤细胞在演变过程中呈现出从缺氧状态(tum2)转为癌细胞增殖状态(tum1)，进而转为炎症反应(tum4)，并最终向细胞迁移状态(tum3)演变。这一发现揭示了肿瘤细胞在演变过程中功能的变化，包括从缺氧状态到形成血管以输送氧气和营养物质，继而发展为进行细胞增殖及细胞迁移相关的肿瘤亚群。同时，还探究了肿瘤细胞在演化过程中变化最为显著的前十个基因，如 图3(c) 所示，这些基因包括：CAMK2N1，CFTR，FXYD3，S100A6，SFRP5，CEACAM6，FXYD2，IFI27，S100P和SLC4A4。这些基因的变化可能反映了肿瘤细胞在演化过程中的关键生物学事件和调控机制，可能是研究肿瘤发生发展的重要线索。

缺氧对于肿瘤的发生发展非常重要，为了研究缺氧肿瘤亚群(tum2)对其他细胞亚群的潜在生物学作用和影响，基于不同细胞亚群中配体和受体表达情况进行细胞间通讯分析，以阐明缺氧肿瘤亚群与其他亚群之间的细胞间相互作用情况。在所有细胞内进行细胞通讯分析，结果如 图4(a) 所示。图中每种颜色的圆代表特定的细胞亚群，圆的大小表示相应细胞亚群中细胞数量的多少；箭头的颜色与配体细胞颜色一致，方向指向受体细胞，箭头的宽度代表所对应的配体与受体细胞之间的通讯强度。从图中可以观察到，肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞作为配体细胞时与其它细胞亚群的通讯强度较大，而肥大细胞和T细胞作为配体细胞时与其它细胞亚群间的通讯强度相对较弱。

通过计算每个细胞亚群在充当配体细胞和受体细胞时的输出通讯强度(Outputting communication strength)和输入通讯强度(Inputting communication strength)，更全面地了解每个细胞亚群在通讯网络中的角色，结果如 图4(b) 所示。成纤维细胞和肿瘤细胞在通讯网络中扮演了重要的角色，它们不仅是主要的信号发送者，也是主要的信号接收者，具有最高的输出通讯强度；肿瘤亚群的通讯强度较为相近，其中tum4亚群的通讯强度最高，可能与其细胞迁移状态有关。

细胞间通讯对应关系如 图4(c) 所示。配体与受体间的交互作用与其涉及的信号通路有关，可以推测各个细胞亚群作为配体细胞时可能介入的信号传递过程，明确每种通讯模式中起主导作用的信号通路，揭示细胞间通讯的复杂性与多样性。共存在八种输出通信模式并共同参与39条信号通路。缺氧肿瘤亚群共参与九种信号通路，如 表1 所示。

通过细胞通讯分析鉴定出了缺氧肿瘤亚群主要参与的信号通路以及分泌的配体，得到了13个信号通路相关的配体，并以其作为候选基因，利用单变量Cox比例风险回归分析筛选与患者的总生存期相关的预后基因，结果如 图5(a) 所示。筛选其中p < 0.05且风险比(Hazard Ratio, HR)大于1的基因，共得到7个基因(LAMC2, LAMB3, LAMA3, AGRN, ANGPTL4, ADM, CDH1)，这些基因与患者的不良预后相关。

利用多变量Cox比例风险回归分析，通过计算出7个预后基因的多变量Cox回归系数后得到风险评分模型，如公式(2)所示：

$\text{Risk score}=0.4952\times {\exp }_{LAMA3}$ (2)

根据患者LAMA3基因表达的中位数进行分组，将患者划分为高风险组和低风险组，并绘制了这两组患者的K-M生存曲线，采用对数秩检验进行统计分析。结果如 图5(b) 所示，高风险组患者的生存率随时间推移而降低的速度显著快于低风险组，这反映出高风险组患者的预后情况更差，且两组之间的差异具有统计学显著性。此外，我们还利用所建立的模型预测了患者在1年、3年和5年时的生存状态，并绘制了ROC曲线以评估模型的预测性能。如 图5(c) 所示，在1年、3年和5年的时间点上，模型的AUC值分别达到了0.763、0.729和0.750，这一结果表明该模型在预测患者生存状态方面具备一定的可靠性和有效性。